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Digestão por Tripsina: Mecanismo, Processo e Aplicações

Proteólise por Tripsina: Mecanismo Molecular e Aplicações Proteômicas

Tripsina é uma protease serina (EC 3.4.21.4) com especificidade requintada para clivagem C-terminal a lisina (K) e arginina (R) resíduos, exceto quando seguido por prolina (P). Essa previsibilidade a torna o cavalo de batalha da proteômica bottom-up.

Mecanismo Catalítico (Tríade de Protease Serina)

1. Ligação do substrato: Cadeia lateral K/R insere no bolso de especificidade S1 (Asp189 na base fornece complementaridade de carga). Exclusão de prolina devido a conflito estérico com Gly216/Gly226.
2. Acilação:
   • His57 atua como base geral, abstraindo próton de Ser195-OH.
   • Ser195-O⁻ nucleofílico ataca carbono carbonila da ligação scissile → intermediário oxônio tetraédrico (estabilizado por NHs de backbone Gly193/Ser195 no buraco de oxônio).
   • Colapso: His57 doa próton ao grupo amina saiente → intermediário acil-enzima.
3. Deacilação:
   • Água ativada por His57 ataca carbonila acila → segundo intermediário tetraédrico.
   • Colapso libera peptídeo C-terminal; Ser195 regenerada.

Determinantes de Especificidade

• Bolso S1: Profundo, negativamente carregado (Asp189) — seleciona resíduos básicos (K, R).
• Subsites S2-S4: Modulam eficiência; preferem resíduos pequenos/hidrofóbicos.
• Bloqueio de prolina: Anel rígido impede alinhamento adequado em S1.

Protocolo de Digestão (Padrão In-Gel/In-Solution)

1. Redução (DTT/TCEP) + alquilação (IAA/CAA) de cisteínas.
2. Adição de tripsina (1:20-1:50 enzima:proteína p/p).
3. Incubação 37°C, 4-16 hrs (ou 1 hr a 50°C com tripsina estabilizada).
4. Extinção (acidificar para pH<3) ou filtrar.
5. Dessalgar (C18 StageTips) → LC-MS/MS.

Aplicações Proteômicas

• Identificação de proteína: Impressão digital de massa de peptídeo (PMF) ou busca de banco de dados LC-MS/MS.
• Proteômica quantitativa: Livre de rótulo, SILAC, TMT/iTRAQ, DIA/SWATH.
• Mapeamento de PTM: Fosforilação, acetilação, ubiquitinação (enriquecimento + tripsina).
• Proteômica estrutural: Proteólise limitada + MS para mapeamento de domínio.
• Descoberta de neoepitopo: Peptidômica MHC, imunoterapia do câncer.

Limitações e Alternativas

• Perde clivagem em ligações K-P/R-P → use Lis-C (cliva apenas K) ou Glu-C (cliva E/D) como proteases complementares.
• Autólise (autodigestão da tripsina) — use tripsina tratada com TPCK ou imobilizada.
• pH/solventes extremos — use variantes estáveis a ácido/térmico.

A previsibilidade, robustez e compatibilidade com MS da tripsina a tornam a protease fundamental para proteômica shotgun.