Como Medir Concentrações de Catalase: Protocolo Espectrofotométrico

Materiais Necessários

• 2 × 110 mL cromógeno em tampão fosfato
• 300 µL substrato – H₂O₂ 30%
• 400 µL HRP – peroxidase de raiz-forte em tampão fosfato
• 60 mL tampão fosfato
• 250 mL diluente de amostra (surfactante em tampão fosfato)
• 2 × 30 mL diluente de substrato (tampão fosfato)
• 2 × 30 mL reagente de parada – azida de sódio
• 2 frascos 160 U/frasco catalase padrão
• Espectrofotômetro
• Pipetas ajustáveis 10 µL
• Cubetas espectrofotométricas 1 cm
• Microtubos polipropileno 1,5 mL com tampa
• Tubos de ensaio 12×75 mm (2,5 mL cada)
• Cronômetro
• Água desionizada

Procedimento

1. Prepare estoque de catalase: adicione 200 µL água desionizada aos frascos de 50 mL com catalase. Concentração final = 160 U/mL.
2. Adicione 30 µL catalase diluída nos tubos. Adicione 500 µL substrato (H₂O₂ 10 mM) em cada. Evite respingos.
3. Incube 1 min à temperatura ambiente.
4. Adicione 500 µL reagente a cada frasco. Feche e misture invertendo (não vórtice, não agite, não mexa).
5. Transfira 20 µL de cada mistura para tubos de ensaio. Adicione 2 mL reagente HRP. Misture invertendo.
6. Incube 10 min à temperatura ambiente.
7. Leia absorbância no espectrofotômetro. Medição de comprimentos de onda identifica substâncias e concentrações. Fornece leitura precisa da catalase, útil para interação catalase-H₂O₂ (como no experimento e no corpo humano).