Protocolo de ensaio de ligação competitiva

Ensaio de ligação competitiva determina capacidade de ligação de proteínas ou químicos para receptores especializados na superfície celular. Método usado em pesquisa médica e para determinar quais fármacos ligam a receptores e modificam sua atividade, alterando comportamento celular.

Preparação celular

Ressuspenda células em salina fosfatada tamponada gelada (PBS). Meça concentração de proteína para confirmar níveis iguais usando ensaio de proteína comercial.

Ensaio

Adicione proteína marcada com radioatividade (ligante) conhecida por ligar ao receptor, à suspensão celular/tecido. Adicione competidor (fármaco ou proteína em estudo) e incube com ligante radioativo e suspensão. Estude faixa de concentrações do fármaco. Após incubação, separe ligante ligado e livre e meça radioatividade.

Análise de dados

Medida usual é concentração que inibe 50% do receptor (IC50). Calculada plotando concentrações em escala logarítmica no eixo X e porcentagem de inibição no Y; curva sigmoide (formato S) deve ser gerada. IC50 é ponto de 50% inibição; concentração correspondente lida no gráfico.