Protocolo de Ensaio de Ligação de Competição

O ensaio de ligação competitiva é uma experiência que determina a capacidade de ligação de proteínas ou produtos químicos para proteínas especializadas que se encontram na superfície de uma célula , denominados receptores . O método é frequentemente usado em investigação médica, mas também é capaz de determinar quais os fármacos se ligam a receptores e modificar a actividade do receptor , que por sua vez podem alterar o comportamento celular . Preparação celular

Re- suspender as células em fosfato gelada solução salina tamponada (PBS). Medir a concentração de proteína para confirmar os níveis iguais de proteína usando um ensaio de proteína disponível comercialmente especializada .
Ensaio

Adicionar uma proteína marcada com radioactividade conhecida por se ligar ao receptor , o ligando , para a suspensão de células ou tecido . Adicionar o competidor , que é a droga de ensaio ou da proteína em estudo e incuba-se com o ligando radioactivo e a suspensão de células . Uma gama de concentrações da droga de teste deve ser estudado . Após a incubação, o ligando ligado e não ligado separado e medir a radioatividade.
Análise de Dados

A medida usual a ser determinado é a metade da concentração máxima que inibe o receptor também conhecido como IC50 . Este valor é calculado pela representação gráfica das concentrações numa escala logarítmica, no eixo X de um gráfico , enquanto o eixo Y representa a percentagem de inibição ; uma curva sigmóide , que é uma forma em S , deve ser gerada . O IC50 é o ponto de inibição de 50 por cento , ea concentração correspondente pode ser lido a partir do gráfico.