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Métodos de Eletroforese em Gel para Comparação de DNA

Princípio da Eletroforese em Gel

A eletroforese em gel é uma técnica padrão para separar DNA, RNA ou proteínas com base no tamanho e carga elétrica. As moléculas migram através de uma matriz de gel (agarose ou poliacrilamida) sob a influência de um campo elétrico. Como o DNA é carregado negativamente, ele se move em direção ao polo positivo (ânodo). Fragmentos menores migram mais rápido que os maiores, permitindo a separação por tamanho.

Principais Tipos de Gel e Aplicações

Gel de Agarose

O método mais comum para visualização de DNA. A concentração de agarose determina a faixa de resolução:

• Baixa porcentagem (0,7-1%): Ideal para fragmentos grandes de DNA (> 10 kb).
• Alta porcentagem (2-3%): Melhor para fragmentos pequenos (< 1 kb).

A visualização é geralmente feita com brometo de etídio (intercala no DNA e fluoresce sob UV) ou corantes mais seguros como SYBR Safe ou GelRed.

Gel de Poliacrilamida

Oferece alta resolução para fragmentos muito pequenos (10 pares de bases a 1 kb). Vantagens incluem:

• Faixa de separação estreita, mas altíssima resolução.
• Capacidade de carregar grandes quantidades de DNA sem perder resolução.

Desafios: Preparação mais complexa; a poliacrilamida pode extinguir a fluorescência do brometo de etídio, dificultando a visualização de pequenas quantidades. Corantes de prata ou fluorescentes são alternativas.

Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)

Essencial para separar moléculas de DNA muito grandes (cromossomos inteiros, megabases). O campo elétrico alterna sua direção periodicamente, permitindo que fragmentos grandes se reorientem e migrem de forma diferenciada. Amplamente usada em genotipagem bacteriana e epidemiologia molecular.

Eletroforese Capilar

Método rápido, automatizado e de alta sensibilidade. O DNA migra dentro de um capilar de sílica preenchido com polímero. A detecção é feita por fluorescência (marcadores fluorescentes) ou UV. Padrão em sequenciamento Sanger e análise de STR forense.

Eletroforese Desnaturante

Usa agentes como ureia ou formamida para desnaturar o DNA (separar as fitas), eliminando a influência da estrutura secundária na migração. Pode ser realizada em géis de agarose ou poliacrilamida. Fundamental para sequenciamento e análise de mutações (ex: SSCP, DGGE).

Critérios de Escolha do Método

• Tamanho dos fragmentos: Agarose (grandes), Poliacrilamida (pequenos), PFGE (muito grandes).
• Resolução necessária: Poliacrilamida e capilar oferecem as melhores.
• Finalidade posterior: Clonagem, sequenciamento, genotipagem, quantificação.
• Recursos e expertise: Agarose é mais simples e barata; capilar requer equipamento especializado.