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Como medir NADH

NAD e NADH são nucleotídeos de piridina envolvidos no metabolismo. NADH e NAD são coenzimas na mitocôndria, usinas de energia da célula. Ambos participam de reações celulares como respiração e fotossíntese onde energia e hidrogênio são gerados. NAD e NADH alimentam reações bioquímicas que requerem enzimas para produzir ATP, principal fonte de energia celular.

Materiais necessários

• Células ou tecido em estudo
• Kit de ensaio de NADH
• Salina fosfatada tamponada
• Gelo seco
• Bloco de aquecimento
• Placa de 96 poços
• Centrífuga
• Tubos rotulados
• Leitor de placa
• Vortex
• Concentração conhecida de NADH

Instruções

Ensaio

1. Lave células/tecido com PBS fria. Extraia células ou rompa tecido em tampão de extração colocando mistura em gelo seco 20 min e depois em temperatura ambiente 10 min. Repita.
2. Vortex 10 seg. Centrifugue 5 min para pelletar detritos. Remova sobrenadante (fase líquida) e coloque em tubo limpo.
3. Filtre sobrenadante em filtro especializado para remover enzimas que degradam NADH.
4. Retire 200 µL, coloque em tubo limpo e aqueça a 60°C em bloco por 30 min para desnaturalizar NAD. Resfrie, centrifuge e remova fase líquida. Transfira 50 µL para placa de 96 poços; cada amostra em duplicata ou triplicata. Para NAD total (NADt), não aqueça.
5. Prepare e adicione mistura de ciclismo à placa. Misture e incube 5 min. Adicione 10 µL de desenvolvedor e incube em temperatura ambiente até 4h. Adicione solução de parada. Leia mudança de cor em leitor de placa ou fluorímetro conforme kit.

Curva padrão e cálculo

6. Prepare curva padrão com concentração conhecida de NADH diluída em tampão de extração. Dilua em diferentes concentrações, mantendo volume final igual ao das amostras. Plaque na mesma placa. Leia densidade óptica.
7. Desenhe gráfico da curva padrão: concentração no eixo X, densidade óptica no Y. Tire média de cada amostra e leia concentração no gráfico.
8. Calcule razão NAD/NADH subtraindo NAD total (NADt) de NADH e dividindo por NADH.