Molecular Cloning Protocols

protocolos de clonagem molecular englobam os procedimentos utilizados para a definição , o isolamento e replicação de uma sequência de ADN . De restrição e de ligação tradicionais protocolos de clonagem iniciar a fragmentação do ADN com endonucleases de restritas (enzimas que cortam cadeias de ADN em locais de restrição), a ligação fragmento de ADN ( a reparação de descontinuidades de moléculas de ADN ) , a transfecção ( a introdução de ácido nucleico numa célula do corpo ) e selecção ( a escolha de genomas individuais para replicação ) . Isolamento

Os protocolos para o isolamento de um fragmento de DNA , o primeiro passo na clonagem molecular , incorporam frequentemente uma reacção em cadeia da polimerase ( PMR ) , a qual utiliza os ciclos de aquecimento e arrefecimento para amplificar fragmentos de DNA . Para atingir o tamanho sequência objectivo , outros protocolos incluem sonicação ADN , digestão com enzimas de reacção e a utilização de oligonucleótidos quimicamente sintetizados . Estes protocolos variam dependendo da magnitude e da quantidade de ADN isolado necessário.

Ligadura

Protocolos para a ligação envolve o uso de uma enzima , a ADN-ligase , para juntar as moléculas de ADN em conjunto com uma ligação covalente . O protocolo dita combinação de fragmentos de ADN , o vector de clonagem , um tampão de ligação , a ligase de ADN e de água esterilizada num tubo de microcentrífuga e a incubação durante a noite a 4 graus Celsius .
Transfecção

Protocolos

para transfecção , ou infusão de ADN para uma célula usando um meio não - virais , muitas vezes envolvem a injecção de ADN directamente no citoplasma da célula . Outros métodos incluem o uso de reagentes químicos , tais como fosfato de cálcio e os lípidos , para entregar o complexo transfecção através da membrana celular . Este método testa os efeitos da modificação genética sobre o funcionamento de genes específicos .
Seleção

seleção ou triagem , os protocolos de determinar quais células realizada com sucesso a inserção de DNA e indicar que as células precisam de isolamento. A centrífuga de células colheitas que contêm o DNA transfectado , que são , em seguida, incubadas num lisozima ( uma enzima que ocorre naturalmente ) de tampão e tratadas com um detergente alcalino , dando as proteínas e membranas solubilidade . Utilização de etilo para precipitar as proteínas , uma centrifugadora e gaze filtrar o sobrenadante contendo DNA ( o líquido solúvel remanescente a partir de um composto centrifugado ) . O sobrenadante foi precipitado com polietilenoglicol , centrifugadas e suspensas num tampão de cloreto de césio e brometo de etídio . O brometo de etídio cora o ADN de acordo com a densidade , e utilizando uma luz UV de onda longa , o ADN de banda baixa é extraída com cinco cc seringa . Uma coluna de permuta iónica equilibrada separa o ADN a partir do brometo de etídio e cloreto de césio , e a pelete final de ADN é suspenso numa solução tampão e detectado em electroforese em gel de agarose .