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Protocolos de Clonagem Molecular

Etapas da Clonagem Molecular: Isolamento, Ligação, Transfeção, Seleção

Protocolos abrangem procedimentos para definir, isolar e replicar sequência de DNA. Clonagem tradicional por restrição/ligação: fragmentação com endonucleases de restrição, ligação de fragmentos, transfeção (introdução de ácido nucleico em célula), seleção (escolha de genomas para replicação).

Isolamento

Primeiro passo. Frequentemente usa PCR (reação em cadeia da polimerase) — ciclos de aquecimento/resfriamento amplificam pedaços de DNA. Para atingir tamanho alvo: sonicação de DNA, digestão enzimática, oligonucleotídeos sintetizados quimicamente. Protocolos variam conforme quantidade e magnitude do DNA necessário.

Ligação (Ligation)

Enzima DNA ligase une fragmentos de DNA com ligação covalente. Protocolo: misturar fragmentos, vetor de clonagem, buffer de ligação, DNA ligase, água estéril em microtubo; incubar overnight a 4 °C.

Transfeção

Infusão de DNA na célula por meio não viral. Injeção direta no citoplasma. Ou reagentes químicos (fosfato de cálcio, lipídios) para atravessar membrana. Testa efeitos de modificação gênica em genes específicos.

Seleção (Screening)

Identifica células que incorporaram o DNA e isola-as. Centrífuga colhe células com DNA transfectado → incubação em buffer de lisozima + detergente alcalino (solubiliza proteínas/membranas) → precipitação de proteínas com acetato → centrífuga + filtro de gaze retém supernatante com DNA → precipitação com PEG → centrífuga → suspensão em buffer de cloreto de césio/brometo de etídio → brometo de etídio cora DNA por densidade → luz UV longa → banda inferior de DNA extraída com seringa 5 cc → coluna de troca iônica equilibrada separa DNA do brometo/césio → pellet final em buffer → detectado em eletroforese em gel de agarose.