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Protocolos de Mutagênese QuikChange para biotecnologia

O que é QuikChange

Mutagênese QuikChange é o nome de marca de um kit usado em pesquisa biotecnológica para induzir mutação genética ou alteração de DNA. A Agilent Technologies é a empresa por trás do produto, disponível em duas versões: QuikChange II e QuikChange Lightning. Ambos os kits contêm solução tampão, enzima DNA polimerase, reagentes de cor, sequências de DNA ou primers, e amostras de células.

Principais protocolos

Protocolo de Síntese de Fita Mutante

Técnicos sintetizam dois oligonucleotídeos ou sequências curtas de DNA contendo a mutação desejada. Então preparam a reação controle com as sequências de DNA, mistura dNTP e enzima DNA polimerase, adicionando água destilada. Depois, preparam uma série de reações de amostra usando várias concentrações de DNA de fita dupla (dsDNA), mantendo concentração de primer ou oligonucleotídeos constante, segundo instruções do fabricante. Mantêm as amostras a 95°C (203°F) por 30 segundos. A amostra contendo segmento de DNA número dois também é testada sob ciclagem de temperatura, técnica onde a temperatura muda durante curtos períodos. Finalmente, as amostras são colocadas no gelo por dois minutos.

Protocolo de Digestão Dpn I dos Produtos de Amplificação

A enzima de restrição Dpn I corta o DNA em sítios específicos. Um microlitro desta enzima é adicionado diretamente a cada reação de amplificação abaixo de sua sobreposição padrão de óleo mineral usando micropipeta ou ponta de pipeta resistente a aerossol especializada. No entanto, sobreposição de óleo mineral só é requerida se o ciclador térmico, aparelho usado para amplificar segmentos de DNA, não tiver montagem de tampa aquecida. A reação é suavemente misturada e depois colocada em microcentrífuga por um minuto. Após isso, as amostras são incubadas a 37°C (98,6°F) por uma hora.

Protocolo de Transformação de Células XL1-Blue Supercompetentes

XL1-Blue é uma linhagem celular resistente a tetraciclina que vem com os kits QuikChange. Durante este protocolo, técnicos descongelam as células, previamente mantidas a -80°C (-112°F), no gelo. Então adicionam um microlitro do DNA tratado com Dpn I, aquecem a 42°C (107,6°F) por 45 segundos e colocam a reação no gelo por dois minutos. Após este procedimento, técnicos adicionam preparação de NZY (hidrolisado de caseína e extrato de levedura) pré-aquecida a 42°C e incubam por uma hora. A preparação é então colocada em placas de ágar gel e incubada a 37°C por 16 horas.