QuikChange Mutagênese Protocolos

mutagênese QuikChange é a marca de um kit utilizado em pesquisas de biotecnologia para induzir mutação genética ou alteração do DNA. Agilent Technologies é a empresa por trás do produto , que está disponível em duas versões, QuikChange II e QuikChange Lightning. Ambos os kits de conter uma solução tampão , a enzima polimerase de ADN , os reagentes de cor , as sequências de DNA ou primers , e amostras de células . Mutant Strand Synthesis Reação Protocolo

Técnicos sintetizar dois oligonucleotídeos ou seqüências de DNA curto contendo a mutação desejada . Em seguida, eles preparar a reacção de controlo com a sequências de ADN , a solução de mistura de dNTP e a enzima polimerase de ADN , adição de água destilada . Posteriormente, preparar uma série de reacções de exemplo utilizando várias concentrações de ADN de cadeia dupla ( dsDNA ) , mantendo a concentração de iniciadores ou oligonucleidos constante , de acordo com as instruções do fabricante . Mantêm-se as amostras a 203 graus F por 30 segundos. A amostra contendo o número do segmento de DNA de dois também é testado sob ciclos de temperatura , uma técnica em que as alterações de temperatura durante curtos períodos de tempo . Finalmente , as amostras são colocadas em gelo durante dois minutos .
Dpnl Digestão do Protocolo de Amplificação de produtos

Dpnl enzima de restrição corta o DNA em sítios específicos . Um micro litros desta enzima é adicionado directamente a cada reacção de amplificação a seguir sua camada de óleo mineral utilizando um padrão de micro - pipeta ou ponta de pipeta aerossol resistentes especializado . No entanto , uma camada de óleo mineral é apenas necessária se o termociclador , um aparelho utilizado para amplificar os segmentos de ADN , não tem um conjunto de hot- top . A reacção é misturada suavemente e depois colocado numa micro - centrífuga durante um minuto . Depois disso , as amostras são incubadas a 98,6 graus F durante uma hora.
Transformação de XL1 -Blue Supercompetent Células Protocolo

XL1 -Blue é uma tetraciclina linha resistente celular que vem com os kits QuikChange mutagênese . Durante este protocolo , os técnicos descongelar as células , que foram previamente mantidos a -112 º C, no gelo. Em seguida, adicionam um micro - litros de DNA tratado com Dpnl , aquecê-lo a 107,6 graus F durante 45 segundos e colocar a reacção em gelo durante dois minutos. Após este procedimento , os técnicos de adicionar uma preparação de NZY ( hidrolisado de caseína e extracto de levedura ) previamente aquecido a 107,6 graus F e incubar durante uma hora . A preparação é então colocado em placas de gel de ágar e incubados a 98,6 graus F por 16 horas .