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Métodos de Interação Proteína-Proteína: Co-IP, Pull-Down, FRET, SPR, ITC, Arrays e Y2H

Estudar interações proteína-proteína (PPIs) requer técnicas complementares para capturar diferentes aspectos: interações binárias vs. complexos, afinidade, cinética e contexto celular. Nenhum único método conta toda a história.

1. Co-Imunoprecipitação (Co-IP)

Um anticorpo puxa a proteína isca junto com parceiros interagentes do lisado celular, preservando complexos nativos. Análise posterior: Western blot ou espectrometria de massa (IP-MS). Limitações incluem interações indiretas, dependência da qualidade do anticorpo e potencial disrupção de interações fracas/transientes durante a lise.

2. Ensaios de Pull-Down

Uma isca marcada (GST, His, FLAG, Strep) é imobilizada em contas e incubada com lisado ou presa purificada. Lavagens removem não-ligadores; eluição e detecção seguem. Excelente para validar interações binárias diretas; realizado in vitro.

3. Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência (FRET)

Fluoróforos doador e aceitador em proteínas interagentes. Transferência de energia (distância de 10–100 Å) produz um sinal ratiométrico. Compatível com células vivas (ex.: pares CFP/YFP, mTurquoise/mVenus). Quantifica proximidade e dinâmica. Requer marcação e transfeção.

4. Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR / BIAcore)

Sem rótulo. Isca imobilizada em um chip de sensor; presa flui sobre ela. Curvas de ligação em tempo real produzem cinética (k_on, k_off), afinidade (K_D) e estequiometria. Alta sensibilidade; requer purificação de proteína.

5. Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)

Mede mudança de calor ao se ligar. Diretamente produz ΔH, ΔS, K_D e estequiometria (n). Sem rótulo; baseado em solução. Requer quantidades de μg–mg de proteína; baixo rendimento.

6. Microarrays de Proteínas

Milhares de proteínas ou peptídeos depositados em uma lâmina. Sondados com isca marcada para triagem de alto rendimento. Uma ferramenta de descoberta; falsos positivos/negativos requerem validação ortogonal.

7. Híbrido de Duas Leveduras (Y2H)

Sistema genético. Isca (domínio de ligação ao DNA) + presa (domínio de ativação) fusão. Interação ativa um gene relatador (HIS3, LacZ). Triagem de bibliotecas in vivo (núcleo da levedura). Propenso a falsos positivos (autoativação) e perde modificações pós-traducionais.

Escolhendo um Método

Objetivo	Método(s) Recomendado(s)
Identificação de complexo endógeno	Co-IP + MS
Validação binária direta	Pull-down, SPR, ITC
Dinâmica ao vivo celular	FRET/BRET
Triagem de alto rendimento	Y2H, microarrays de proteínas
Termodinâmica	ITC
Cinética	SPR

Validação ortogonal (dois ou mais métodos) é o padrão para PPIs de alta confiança.