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Criopreservação: Métodos e Técnicas para Armazenamento de Longo Prazo de Células

Procedimentos de criopreservação permitem armazenar células indefinidamente usando temperaturas extremamente frias para suspender atividades metabólicas. Existem dois tipos principais: equilíbrio (congelamento lento convencional) e não equilíbrio ou ultra-rápido (vitrificação). Termo vitrificação vem do latim "vitreous" ou vítreo. Ambos usam crioprotetores com propriedades anticongelantes para prevenir dano celular durante congelamento. Uma vez congeladas ou vitrificadas, células podem ser armazenadas indefinidamente imersas em nitrogênio líquido, fluido extremamente frio a -196°C (-321°F). Para restaurar atividade metabólica na célula ao descongelar, crioprotetores tóxicos devem ser removidos e equilíbrio hídrico normal restaurado gradualmente enquanto a célula retorna à temperatura funcional normal.

Visão Geral

Procedimentos de criopreservação permitem armazenar células indefinidamente usando temperaturas extremamente frias para suspender atividades metabólicas. Existem dois tipos principais: equilíbrio (congelamento lento convencional) e não equilíbrio ou ultra-rápido (vitrificação). O termo vitrificação vem do latim "vitreous" ou vítreo. Ambos usam crioprotetores com propriedades anticongelantes para prevenir dano celular durante congelamento. Uma vez congeladas ou vitrificadas, células podem ser armazenadas indefinidamente imersas em nitrogênio líquido, fluido extremamente frio a -196°C (-321°F). Para restaurar atividade metabólica na célula ao descongelar, crioprotetores tóxicos devem ser removidos e equilíbrio hídrico normal restaurado gradualmente enquanto a célula retorna à temperatura funcional normal.

Fatores Específicos da Célula

Procedimento para criopreservar células ou tecido depende de fatores incluindo tamanho da célula, quantidade de fluido celular (citoplasma) e complexidade (célula única ou tecido). Células com grande citoplasma como óvulos são mais difíceis de criopreservar que células com citoplasma residual, como espermatozoides. Criopreservação de tecido ovariano é mais desafiadora pois pelo menos três tipos celulares de tamanhos variados estão presentes, cada um com necessidades ótimas de congelamento diferentes. Protocolos de congelamento lento usados com sucesso em vários tipos celulares. Vitrificação atualmente mais eficaz com congelamento de célula única e menos com tecidos, mas pesquisa continua para otimizar vitrificação de tecidos.

Papel dos Crioprotetores

Citoplasma contém água, que vira cristais de gelo na temperatura de congelamento. Quando gelo forma dentro da célula, ela é destruída e morre. Portanto, fluido na célula precisa ser removido antes de atingir temperaturas de congelamento para evitar dano. Vários tipos de fluidos anticongelantes (crioprotetores) podem desidratar célula antes do congelamento: glicerol, propanodiol, dimetil sulfóxido (DMSO), etanol e açúcares como sacarose e trealose. Taxa ótima de resfriamento (e descongelamento) depende do tipo de crioprotetor e características da célula/tecido. Crioprotetores são tóxicos a células metabolizantes, então exposição a temperaturas metabólicas mais quentes deve ser minimizada ou evitada. Ao descongelar/aquecer células, crioprotetores devem ser completamente removidos antes de restaurar atividade metabólica.

Procedimento de Criopreservação Equilíbrio vs. Não Equilíbrio

Taxa de congelamento depende se protocolo é baseado em equilíbrio ou não equilíbrio. Para equilíbrio, taxa ótima alcançada quando há equilíbrio entre taxa de desidratação celular e taxa de transformação de água extracelular em gelo. Protocolos de equilíbrio ou congelamento lento geralmente levam horas e computador controla freezer programável para garantir taxas exatas. Há tipicamente etapa "hold" no início para permitir criação manual de cristais de gelo iniciais ou "seeding" no fluido extracelular.

Na vitrificação, abordagem inteiramente diferente não baseada em rampas e equilíbrio entre desidratação e formação de cristais é usada. Vitrificação é tão ultra-rápida que não há tempo para formação de gelo e fluido celular converte-se diretamente em fase vítrea ou de vidro, sem dano à célula. Freezers programáveis não são necessários pois célula é mergulhada diretamente em nitrogênio líquido extremamente frio, alcançando estado vítreo instantâneo.

Procedimento de Congelamento Lento

Primeiro passo: expor célula a crioprotetor de forma gradual e escalonada para permitir equilíbriação lenta da célula com crioprotetor enquanto libera água. Uma vez células livres da maior parte da água celular, colocadas em recipiente (canudo plástico, ampola de vidro ou frasco plástico). Volume de líquido circundante para congelamento lento tipicamente menos que colher de chá, podendo ser apenas algumas gotas. Recipiente pré-rotulado é preenchido, selado e posto em freezer programável, que diminui lentamente temperatura por minutos ou horas a temperaturas muito baixas. Após alguns minutos de resfriamento, cristais de gelo iniciais devem ser formados dentro do recipiente por "seeding". Seeding realizado usando ferramenta (ex: pinças) pré-resfriadas em nitrogênio líquido para tocar recipiente e causar formação de cristais. Esse cristal inicial iniciará formação controlada de cristais em um ponto, seguro longe das células. Uma vez seeding completo, rampas de resfriamento restantes prosseguem. Quando recipiente atinge -30 a -85°C, pode ser mergulhado diretamente em nitrogênio líquido para completar resfriamento a -196°C.

Vitrificação

Procedimentos ultra-rápidos de não equilíbrio como vitrificação usam concentrações maiores de crioprotetores acopladas a taxa de congelamento quase instantânea mergulhando células diretamente em nitrogênio líquido. Vitrificação contorna fase de formação de cristais de gelo e move água diretamente para fase vítrea. Alcança mesmo ponto final do congelamento lento, mas a taxa de -3000°C/min, comparado a 10°C/min ou mais. Para vitrificação, células geralmente colocadas na ponta de canudo e excesso de crioprotetor removido, deixando apenas o suficiente para célula aderir ao recipiente por tensão superficial, antes de mergulhar em nitrogênio líquido. Como congelamento é tão rápido, duração de exposição a crioprotetores é muito menor, e concentrações muito maiores podem ser toleradas. Aquecimento da célula para retornar à função metabólica normal também deve ser incrivelmente rápido. Manuseio de amostras vitrificadas é muito mais exigente que congeladas lentamente porque mesmo breve exposição a temperatura acima do nitrogênio líquido pode iniciar aquecimento não planejado e recongelamento, prejudicial à célula.