Procedimentos de criopreservação

procedimentos de criopreservação são aquelas que permitem células para ser armazenado indefinidamente utilizando temperaturas extremamente baixas para suspender as actividades metabólicas . Existem dois tipos principais de procedimentos de criopreservação (congelamento de equilíbrio : lento convencional ) e não-equilíbrio ou congelamento ultra- rápido ( vitrificação ) . O termo vitrificação vem do latim " vítreo " ou vítreo. Ambos os processos utilizam os crioprotectores com propriedades de tipo anti-congelante para prevenir o dano celular durante o processo de congelação . Uma vez que as células são congeladas ou vitrificada , que pode ser armazenado indefinidamente por imersão em azoto líquido , um fluido extremamente frio com uma temperatura de -196 C ( -321 C ) . Para restaurar a actividade metabólica da célula após a descongelação , os crioprotectores tóxicos deve ser removido a partir da célula e o equilíbrio normal da água gradualmente restabelecida como a célula é retornado a uma temperatura normal de funcionamento . Geral

Geral

procedimentos de criopreservação são aqueles que permitem as células a serem armazenados indefinidamente usando temperaturas extremamente frias para suspender as atividades metabólicas. Existem dois tipos principais de procedimentos de criopreservação (congelamento de equilíbrio : lento convencional ) e não-equilíbrio ou congelamento ultra- rápido ( vitrificação ) . O termo vitrificação vem do latim " vítreo " ou vítreo. Ambos os processos utilizam os crioprotectores com propriedades de tipo anti-congelante para prevenir o dano celular durante o processo de congelação . Uma vez que as células são congeladas ou vitrificada , que pode ser armazenado indefinidamente por imersão em azoto líquido , um fluido extremamente frio com uma temperatura de -196 C ( -321 C ) . Para restaurar a actividade metabólica da célula após a descongelação , os crioprotectores tóxicos deve ser removido a partir da célula e o equilíbrio normal da água gradualmente restabelecida como a célula é retornado a uma temperatura normal de funcionamento .
- Celular os factores específicos

o procedimento utilizado para a criopreservação de células ou de tecidos depende de um número de factores, incluindo o tamanho da célula , a quantidade de fluido celular ( citoplasma ) e a complexidade da célula ( ou uma única célula de tecido ) . As células com uma grande quantidade de citoplasma , tais como os ovos são mais difíceis de criopreservar de células com citoplasma apenas residual , tal como as células do esperma . Criopreservação de tecido ovariano é mais um desafio, porque pelo menos três tipos diferentes de células de tamanhos variados estão presentes no tecido ovariano , cada um com diferentes necessidades de congelamento ideais. Os protocolos de congelação lenta , têm sido utilizados com sucesso com vários tipos de células . Vitrificação atualmente é mais eficaz com o congelamento de uma única célula e menos eficaz com os tecidos , mas a investigação está em andamento para otimizar a vitrificação dos tecidos.
Papel da Crioprotetores

O citoplasma de uma célula contém água, que se transforma em cristais de gelo à temperatura de congelamento. Quando o gelo se forma no interior de uma célula , a célula é desfiado e morre . Portanto , o fluido na célula necessita de ser removida antes de atingir temperaturas de congelação para evitar danos nas células . Vários tipos de anti-congelantes fluidos ( crioprotectores ) pode ser utilizado para desidratar a célula , antes da congelação , incluindo glicerol , propanodiol , sulfoxde dimetilo ( DMSO ) , o etanol e os açúcares tais como sacarose e trealose . A taxa óptima de arrefecimento ( e descongelamento ) depende do tipo de crioprotector utilizado e da característica da célula ou tecido a ser ( ou que foi ) congelado . Crioprotectores são tóxicos para as células de modo metabolizar exposições celulares a crioprotectores a temperaturas mais quentes metabólicas deve ser minimizado ou evitado . Após o descongelamento ou aquecimento das células, crioprotetores deve ser completamente removido da célula antes da atividade metabólica é restaurada.
Equilibrium Versus Non- Equilibrium Criopreservação Procedimento

A taxa de congelamento depende se o protocolo de congelação é - equilíbrio ou não baseada equilbrium . Para os procedimentos de tipo de equilíbrio , a velocidade de congelação óptima é conseguida quando há um equilíbrio entre a velocidade à qual a célula está a ser desidratado da água e da taxa à qual a água está fora da célula a ser transformada para a fase de gelo . Estes protocolos de equilíbrio ou de congelamento lento costumam levar horas para ser concluído e um computador é usado para executar um freezer taxa programável para garantir que as taxas de congelamento são exatamente conforme necessário. Há normalmente um "hold" passo no protocolo de perto do início para permitir a criação manual de cristais de gelo de arranque , ou " seeding" no fluido no exterior das células .

vitrificação , uma abordagem completamente diferente de congelação que não depende de rampas e alcançar um equilíbrio entre a desidratação e a formação de cristais de gelo é usado . A vitrificação é então ultra- rápida que não há tempo suficiente para a formação de gelo e o fluido celular é convertido directamente numa fase vítrea ou de vidro , sem danos para a célula . Freezers taxa programáveis não são necessários porque a célula está diretamente mergulhado em nitrogênio líquido extremamente frio , atingindo um estado vítreo instantânea.
Lento -Freeze Procedimento

A primeira etapa do o processo de congelação lenta é para expor a célula de crioprotector de forma gradual progressiva para permitir o equilíbrio lentamente da célula com o crioprotector enquanto liberta água . Uma vez que as células tenham sido apagadas da maioria da água celular , as células do fluido de crioprotector são colocadas dentro de um recipiente de algum tipo , tal como um canudo de plástico , uma ampola de vidro ou um volume vial.The plástico de líquido em torno das células para congelamento lento é tipicamente menos do que uma colher de chá e só pode ser algumas gotas . O recipiente pré - marcado é cheio , selado e colocado num congelador programável , que diminui lentamente a temperatura do recipiente ao longo de um período de minutos ou horas, a temperaturas muito baixas . Depois de alguns minutos de arrefecimento , os cristais de gelo de partida deve ser formado no interior do recipiente por " sementeira " o recipiente . Sementeira é realizada usando uma ferramenta (por exemplo , uma pinça ) , que tenham sido pré - arrefecidos em azoto líquido para tocar o recipiente e provocar a formação de cristais de gelo . Este cristal partida vai iniciar a formação de cristais de gelo controlada em um ponto, a uma distância segura das células. Uma vez que a semeadura é completa , o resto das rampas de arrefecimento pode continuar. Quando o recipiente atinge temperaturas entre -30 e -85 C , o recipiente que contém as células podem ser mergulhados directamente no azoto líquido para preencher o arrefecimento até -196 C.
Vitrificação
procedimentos não-equilíbrio refrigeração ultra- rápidas

como vitrificação usar maiores concentrações de crioprotetores , juntamente com uma taxa de congelamento quase instantâneo alcançado mergulhando células diretamente em nitrogênio líquido. Vitrificação ignora a fase de formação de cristais de gelo e se move a água diretamente em uma fase como vidro . Vitrificação atinge o mesmo ponto final como a congelação lenta , mas a uma taxa de -3000C/min , em comparação com 10C/min ou mais . Para a vitrificação , as células são geralmente colocadas na ponta de uma haste e o excesso de agente crioprotector é removido , deixando apenas o suficiente de modo a que a célula se adere ao recipiente por tensão superficial , antes de mergulhar em azoto líquido . Porque congelamento é tão rápido , o tempo de exposição à crioprotectores é muito menor , e concentrações muito mais elevadas de agentes crioprotectores pode ser tolerada pela célula . O aquecimento do celular para devolvê-lo para o funcionamento metabólico normal deve também ser incrivelmente rápido . A manipulação das amostras vitrificados é muito mais exigente do que as amostras congeladas - lento , porque até mesmo uma breve exposição a uma temperatura superior à do azoto líquido pode iniciar um processo de aquecimento não planeada e recongelar , o que é prejudicial à célula .