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Métodos essenciais de citometria de fluxo

Citometria de fluxo envolve o princípio de focalização hidrodinâmica, usando fonte de excitação luminosa como laser, para medir e analisar características físicas de partículas individuais. É predominantemente aplicada à análise celular; propriedades analisadas incluem tamanho celular, granulosidade e intensidade de fluorescência. Métodos essenciais de detecção incluem luz dispersa frontal (forward-scattered), luz dispersa lateral (side-scattered) e fluorescência.

Citômetro de fluxo

• Compreende sistemas de fluidos, óptica e eletrônica. O sistema de fluidos transporta a amostra ao feixe de laser para interrogacão. O sistema óptico contém lasers e filtros ópticos que iluminam amostras e direcionam sinais de luz aos detectores relevantes. Luz detectada é convertida em sinais eletrônicos pelo sistema eletrônico, para interpretação pelo computador.

Luz dispersa frontal (Forward-Scattered Light - FSC)

• Luz difratada dispersa em direção frontal é detectada aproximadamente 20 graus do eixo do feixe de laser por um fotodiodo chamado canal de dispersão frontal (FSC). Luz dispersa frontal é diretamente proporcional à área de superfície da partícula, usada como indicador de tamanho celular e para distinguir células vivas e mortas. Devido a estas características, FSC é aplicado à imunofenotipagem como gatilho de processamento de sinal.

Luz dispersa lateral (Side-Scattered Light - SSC)

• Luz dispersa lateral refere-se à luz refratada em qualquer interface celular, medida a aproximadamente 90 graus do eixo do laser pelo canal de dispersa lateral (SSC), redirecionada ao detector relevante por divisor de feixe. Luz dispersa lateral é aproximadamente equivalente à granulosidade celular ou complexidade interna, usada para determinar conteúdo granular das células. Dispersa lateral e frontal são usadas em combinação para distinguir diferentes tipos celulares.

Fluorescência

• Fornece informação quantitativa e qualitativa sobre moléculas intracelulares (citoquinas, DNA) e receptores de superfície celular, usando marcadores fluorocromos e medindo em diferentes comprimentos de onda. Cada fluorocromo tem faixa de comprimento de onda específica na qual a luz é absorvida (espectro de absorção). Fluorescência funciona quando fóton de luz é emitido por elétron excitado após absorção de luz.