Como Preparar Placas de Ágar

Biologia molecular e bacteriologia usam placas de ágar para cultivar microrganismos como bactérias para experimentação. O ágar é o agente que solidifica, ou gelifica, um meio nutritivo líquido necessário para o microrganismo sobreviver e crescer. Uma vez transferidas para uma placa de ágar, as bactérias crescem em colônias distintas (se cultivadas em baixas concentrações) ou manchas (se em altas concentrações) e podem ser colhidas para análise. Biólogos preparam placas de ágar, pois o processo requer acesso a reagentes e equipamentos de laboratório e boa compreensão de biologia molecular e técnicas estéreis.

Materiais Necessários

• Luvas
• Jaleco de laboratório
• Máscara facial
• Bico de Bunsen
• Capela de fluxo laminar
• Placas de Petri estéreis
• 10g bacto-triptona
• 5g extrato de levedura
• 15g agarose
• 1mL NaOH 1N
• Água destilada estéril
• Frasco de vidro
• Fita de autoclave
• Autoclave
• Suplementos, ex.: antibióticos como ampicilina

Instruções

1. Coloque equipamento de proteção adequado, incluindo luvas, jaleco e máscara facial, e descontamine todas as superfícies. Trabalhe próximo a um bico de Bunsen ou, preferencialmente, em uma capela de fluxo laminar estéril. Isso impede que contaminantes aerotransportados caiam no ágar.

2. Remova a pilha de placas de Petri da embalagem, mas guarde para reembalar as placas de ágar. Rotule a superfície externa da placa (não a tampa) com o tipo de ágar e a data de preparo. Disponha as placas em camada única com as tampas removidas para facilitar o vazamento do ágar.

3. Misture a bacto-triptona, extrato de levedura e agarose e adicione a solução de hidróxido de sódio (NaOH). Adicione água destilada estéril para obter 1L de meio nutritivo. Transfira esta solução para um frasco de vidro com volume mínimo de 1,5L. Rosqueie a tampa frouxamente e rotule a data de preparo e o nome do meio. Coloque uma fita de autoclave no frasco e autocleve por 25 minutos. Deixe o frasco esfriar a não menos que 45°C (ou endurecerá prematuramente) nem mais que 50°C. Frascos de ágar esfriado e solidificado podem ser armazenados a 4°C e então aquecidos até liquefazer. Se necessário para seu experimento ou cepa bacteriana, adicione o tipo e quantidade apropriados de suplemento, como antibióticos. Se o meio estiver muito quente, os suplementos serão destruídos, então verifique cuidadosamente a temperatura antes de prosseguir.

4. Despeje volume suficiente de ágar para preencher metade da placa enquanto ainda estiver morno e líquido. Certifique-se de que a superfície esteja completamente coberta. Não despeje quantidade excessiva nem deixe o ágar atingir a borda da placa. Mantenha as placas em atmosfera estéril permitindo que o bico de Bunsen ou a capela de fluxo laminar funcionem continuamente. Deixe as placas solidificarem e recoloque as tampas.

5. Seque as placas de ágar por cerca de 30 minutos a uma hora em estufa a no máximo 37°C. Alternativamente, deixe-as na capela de fluxo laminar por três minutos ou em bancada de laboratório descontaminada em área de baixo tráfego sem correntes de ar por um ou dois dias. A secagem impede que qualquer solução bacteriana colocada na superfície do ágar simplesmente se dilua e escorregue, em vez de formar colônias que aderem ao ágar.

6. Armazene cuidadosamente as placas no escuro e a 4°C. Empilhe as placas de ágar secas com o fundo para cima para permitir visualização clara dos rótulos e evitar que microrganismos e detritos caiam na superfície do ágar contaminando-as. Coloque as placas de volta na embalagem, cubra com papel alumínio e feche a embalagem com fita. Rotule as placas embaladas com seu conteúdo e data de preparo. As placas podem ser armazenadas por até dois meses e devem ser descartadas após esse período.