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Protocolo de Coloração com DAPI para DNA de Dupla Fita

DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) é corante fluorescente que se intercala no DNA de dupla fita (preferência por regiões ricas em AT). Forma complexos azul-fluorescentes com núcleos celulares, amplamente usado em microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e contagem celular. O padrão e intensidade da coloração também permitem identificar células mortas/apoptóticas (núcleos fragmentados, condensados).

Preparação da Solução de Trabalho

DAPI comercial (ex.: Invitrogen/Molecular Probes) geralmente vem como pó liofilizado ou solução estoque concentrada (ex.: 5 mg/ml em DMSO).

1. Estoque: 10 mg DAPI em 2 ml água deionizada = 5 mg/ml (~8,3 mM). Aliquote, proteja da luz, -20°C (estável por meses).
2. Solução de trabalho: dilua o estoque em PBS (phosphate-buffered saline) para concentração final de 0,1-1 µg/ml (comum: 300 nM ≈ 0,1 µg/ml). Ex.: 6 µl de estoque 5 mg/ml em 10 ml PBS = 300 nM.
3. Prepare fresco no dia do uso; DAPI é fotossensível.

Preparo da Amostra e Coloração

1. Fixe a amostra em lâmina: formaldeído 3-4% / paraformaldeído 4% por 10-15 min à temperatura ambiente (ou metanol -20°C 5 min para citologia).
2. Lave 2-3x com PBS.
3. Permeabilize se necessário (Triton X-100 0,1-0,5% em PBS, 5-10 min) para anticorpos intracelulares; DAPI penetra membranas intactas, mas permeabilização uniformiza.
4. Adicione 300 µl da solução de trabalho de DAPI por lâmina (câmara de umidade).
5. Incube 1-5 min à temperatura ambiente, protegido da luz.
6. Lave 2-3x com PBS (remove DAPI livre, reduz fundo).
7. Monte com meio antifade (ProLong Gold, Vectashield, Fluoromount-G) + lamínula.
8. Sele bordas com esmalte ou guarde a 4°C protegido da luz para imagem no mesmo dia.

Análise por Microscopia de Fluorescência

• Filtro DAPI: excitação ~358 nm, emissão ~461 nm (azul).
• Objetiva 20x-60x (óleo/água) para detalhe nuclear.
• Controles: amostra sem DAPI (autofluorescência), amostra sem DNA (RNase prévia), controle de positividade.
• Quantificação: software (ImageJ/Fiji, CellProfiler, Imaris) para área nuclear, intensidade integrada, contagem, morfologia (fragmentação apoptótica).

Segurança: DAPI é mutagênico potencial (intercalador de DNA). Use luvas, óculos, avental, manipule em capela. Descarte resíduos conforme norma de resíduos químicos.