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Como Determinar a Concentração de Amilase no Sangue

Introdução

Enzimas amilase são produzidas no pâncreas e nas glândulas salivares e ajudam a digerir e processar carboidratos. Quando o pâncreas adoece, a amilase é liberada na corrente sanguínea. Quando um paciente apresenta problemas no trato digestivo ou doença pancreática, o médico solicitará um exame de sangue para estabelecer o nível de amilase no sangue. O monitoramento dos níveis de enzima amilase fornecerá muita informação sobre a progressão da doença e os efeitos do tratamento.

O que Você Vai Precisar

• Espectrofotômetro UV/Vis
• 15 tubos de ensaio grandes
• Suporte para tubos de ensaio
• Solução de amido 1 mg/ml
• Água desionizada
• Reagente KI/iodo
• Pipetas
• Conta-gotas
• Papel tissue
• Cuvetes
• Papel milimetrado
• Amostra de sangue
• Centrífuga
• Cronômetro

Instruções

Preparação da Curva Padrão de Amido

1. Ligue o espectrofotômetro e ajuste-o para um comprimento de onda de 620 nm. Permita que o instrumento aqueça por no mínimo 10 minutos para que a resposta seja estável durante o experimento.
2. Separe seis tubos de ensaio, rotule-os de 1 a 6 e coloque-os no suporte. Organize as soluções de amido, água desionizada e solução de KI/iodo na bancada.
3. Encha o tubo 1 com 3 ml de água desionizada usando uma pipeta; este servirá como branco. Encha os tubos 2-6 com 3,0 ml, 2,9 ml, 2,7 ml, 2,4 ml e 2,1 ml de água desionizada, respectivamente. Adicione solução de amido a cada um dos tubos 2-6 na seguinte ordem: tubo 2 recebe 0 ml, tubo 3 recebe 0,1 ml, tubo 4 recebe 0,3 ml, tubo 5 recebe 0,6 ml e tubo 6 recebe 0,9 ml.
4. Adicione uma gota de solução KI/iodo a cada um dos seis tubos. Misture cuidadosamente cada tubo completamente antes de registrar sua absorbância no espectrofotômetro.
5. Encha a cuveta com a solução branco, limpe o exterior da cuveta e coloque-a no orifício do branco do espectrofotômetro. Ajuste a absorbância para zero. Todas as outras soluções renderão absorbância positiva.
6. Encha a cuveta de amostra com cada uma das outras cinco soluções, por sua vez. Limpe o exterior da cuveta antes de cada medição. Registre o valor de absorbância para cada tubo. Enxágue a cuveta com a nova solução pelo menos uma vez antes de encher para o teste.
7. Faça um gráfico que plote as leituras de absorbância contra a concentração de amido. Esta é a curva padrão que permite determinar a concentração de uma solução que tem uma leitura de absorbância dada.

Determinação da Concentração de Amilase

8. Limpe todos os tubos de ensaio da primeira parte do teste. Guarde o tubo branco para uso posterior.
9. Obtenha uma amostra de sangue do paciente. Coloque a amostra em uma centrífuga e separe os glóbulos vermelhos do plasma sanguíneo.
10. Encha um tubo de ensaio com 9 ml de água desionizada e 1 ml do plasma sanguíneo. Esta é uma diluição 1:10 do plasma. Misture bem o tubo e pipoete 1 ml da solução em um segundo tubo de ensaio. Rotule os dois tubos com seu conteúdo.
11. Prepare-se para realizar um teste cronometrado. Tenha um cronômetro à mão e prepare sete tubos de ensaio com cuvetas no suporte. Você fará leituras a cada dois minutos após o início do teste. Registre o tempo exato e a leitura de absorbância para cada um dos sete pontos de dados. Encha cada um dos sete tubos com 2 ml de água desionizada.
12. Adicione 9 ml da solução de amido ao tubo de ensaio que tem 1 ml da diluição 1:10 do plasma. Assim que começar a adicionar a solução de amido, inicie o cronômetro. Misture bem o tubo e pipoete 1 ml da solução amido/plasma no primeiro dos sete tubos. Registre o tempo. Adicione 1 gota de solução KI/iodo ao tubo e misture.
13. Transfira para a cuveta, limpe o exterior e registre a absorbância. Repita o processo com os seis tubos restantes em intervalos de dois minutos. Ao final do teste cronometrado, você deve ter leituras para o tempo real e absorbância para os intervalos de 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 minutos.
14. Use a curva padrão para encontrar a concentração de amido para cada um dos sete pontos de dados. Esses pontos diminuirão com o tempo. A amilase digere o amido e, com o tempo, consome todo o amido disponível.
15. Faça um gráfico dos pontos de dados do teste cronometrado como concentração de amido versus tempo. A inclinação desta curva indica a quantidade de amilase na amostra de plasma.