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Determinação Espectrofotométrica do Ponto Final para Hidrólise de Caseína por Tripsina

Princípio

Hidrólise da caseína → ↓ turbidez (clareamento) + ↑ peptídeos/aminoácidos solúveis. A absorbância a 280 nm (AAs aromáticos) ou 440 nm (ensaio colorimétrico com TCA/Folin) aumenta à medida que os peptídeos se acumulam. Mais objetivo que o esclarecimento visual.

Protocolo Otimizado

Materiais

• Solução de tripsina (ex.: 0,1 mg/mL em 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM CaCl₂)
• Substrato de caseína (1% p/v no mesmo buffer; ou azocaseína para colorimétrico)
• Solução de parada: 10% TCA ou 0,5 M NaOH (desnatura tripsina)
• Espectrofotômetro + cubetas de quartzo (1 cm de caminho)
• Banho-maria (37°C)

Procedimento

1. Pré-aqueça substrato e enzima separadamente (37°C, 5 min).
2. Inicie a reação: Misture 1 mL de caseína + 0,1 mL de tripsina ([E] final definido). Inicie o cronômetro.
3. Em intervalos (0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 min), retire alíquota de 0,2 mL → 0,8 mL de solução de parada. Vórtex.
4. Centrifugue 10.000g × 5 min (remova proteína precipitada).
5. Meça A₂₈₀ do sobrenadante (ligações peptídicas) ou execute Folin-Lowry/BCA no sobrenadante para quantificação total de peptídeos.
6. Plote A₂₈₀ (ou μg peptídeo/mL) vs. tempo.

Determinação do Ponto Final

• Método da taxa inicial (preferido): Regressão linear dos primeiros pontos de tempo (0–10% de hidrólise) → V₀ (ΔA/min). Evita ambiguidade do ponto final.
• Método do platô: Tempo em que ΔA/Δt <5% da taxa inicial (reação próxima da conclusão).
• Ensaio de tempo fixo: Compare A em tempo definido (ex.: 10 min) com curva padrão (hidrolisado de caseína).

Vantagens sobre o Esclarecimento Visual

• Quantitativo, reproduzível, dados cinéticos (K_m, V_max possíveis).
• Insensível a viés do observador, iluminação, tamanho de partículas.
• Detecta hidrólise precoce antes do clareamento visível.

Armadilhas Comuns

• Variabilidade do lote de caseína → execute curva padrão a cada ensaio.
• Precipitação de TCA incompleta → espalhamento a 280 nm. Use filtro de 0,22 μm.
• Autólise da tripsina a 37°C → inclua branco apenas com enzima.