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Tecnologias de Amplificação por Ramificação (Branching Amplification): Protocolos e Aplicações em Diagnóstico Molecular

Conceito: Amplificação Isotérmica por Ramificação (RAM, RCA, HDA, LAMP, RPA, SDA, NASBA, 3SR)

Alternativas ao PCR convencional (ciclagem térmica). Usam enzimas com atividade de deslocamento de fita (strand displacement) para amplificação exponencial a temperatura constante (isotérmica). Vantagens: equipamento simples, rápido, portátil, adequado para ponto-de-cuidado (POC) e recursos limitados.

Principais Tecnologias

1. LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) — Notomi et al., 2000

• 4-6 primers (F3, B3, FIP, BIP, Loop F, Loop B) reconhecem 6-8 regiões alvo.
• Bst DNA polimerase (deslocamento de fita forte) a 60-65°C.
• Forma estruturas em "laço" (dumbbell) → amplificação autocíclica exponencial.
• Detecção: turbidez (pirofosfato Mg²⁺), fluorescência (SYBR Green, calceína), mudança de cor (HNB), eletroquímica.
• Aplicações: TB (MTB), COVID-19, malaria, Zika, dengue, HPV, patógenos alimentares, oncologia (mutação EGFR, KRAS).

2. RPA (Recombinase Polymerase Amplification) — Piepenburg et al., 2006

• Recombinases (UvsX/UvsY) + SSB + polimerase strand-displacing (Bsu) a 37-42°C.
• Primers tipo PCR (2 primers). Mais simples que LAMP.
• Tempo: 15-20 min. Liofilizado → estável temperatura ambiente.
• Comercial: TwistDx (agora Abbott). Kits POC para TB, HPV, HIV, vírus emergentes.

3. HDA (Helicase-Dependent Amplification) — Vincent et al., 2004

• Helicase (Tte UvrD) separa fitas + polimerase Bsu a 65°C (tHDA) ou 37°C (mesophilic HDA).
• Similar ao PCR mas isotérmico. 2 primers.
• Comercial: BioHelix (agora Quidel) — IsoAmp® HSV, GBS, etc.

4. RCA (Rolling Circle Amplification) — Lizardi et al., 1998

• Sonda circular (padlock probe) ligada ao alvo → polimerase φ29 (processividade extrema) sintetiza concatêmero linear repetido.
• Detecção: hibridização com sondas fluorescentes, nanopartículas, eletroquímica.
• Ultra-sensível (single molecule). Genotipagem SNP, detecção microRNA, proteinas (immuno-RCA).

5. NASBA / 3SR (Transcrição Baseada em Amplificação de Ácido Nucleico)

• Alvo RNA. T7 RNA polimerase + RT + RNase H a 41°C.
• Amplifica RNA → ideal para vírus RNA (HIV, HCV, SARS-CoV-2, enterovírus) e expressão gênica.
• Comercial: bioMérieux (NucliSENS EasyQ).

Aplicações Clínicas Destacadas

Doenças Infecciosas (POC / Baixo Recurso)

• TB: LAMP (TB-LAMP, OMS recomendado 2016) — sensibilidade > microscopia, < PCR; 1h, equipamento simples.
• HIV carga viral: NASBA (EasyQ) — quantitativo, plasma/sangue total.
• HPV: LAMP/RPA para genotipagem alto risco (16, 18, 45...).
• Malária: LAMP (Loopamp™) — sensibilidade ~ PCR, detecta assintomáticos.
• COVID-19: LAMP colorimétrico (pH), RPA-CRISPR (SHERLOCK, DETECTR) — teste rápido molecular.

Genética / Oncologia

• Detecção mutações hotspot (EGFR L858R, T790M; KRAS G12C/D/V; BRAF V600E) — biópsia líquida (ctDNA).
• Fusões gênicas (BCR-ABL, EML4-ALK, NTRK) — RCA, LAMP multiplex.
• Metilação promotor (SEPT9, SHOX2) — detecção precoce câncer colorretal/pulmão.

Segurança Alimentar / Ambiental

• E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella, Campylobacter, Listeria — LAMP/RPA em 30-60 min vs. cultura 24-48h.
• Detecção simultânea multiplex (painéis 10-20 patógenos).

Desafios e Limitações

• Design de primers complexo (LAMP: 4-6 primers; dimerização, falsos positivos).
• Contaminação por aerossol (amplicons abundantes) — UDG/dUTP, dispositivos fechados,/rooms separados.
• Quantificação menos robusta que qPCR (curva padrão, eficiência variável).
• Inibidores de amostra clínica (sangue, fezes, escarro) — extração rápida necessária.
• Regulação: IVD (ANVISA, FDA, CE-IVDR) — validação analítica/clínica rigorosa.

Futuro: CRISPR-Cas + Amplificação Isotérmica (SHERLOCK, DETECTR, HOLMES)

• Cas12/Cas13: atividade colateral trans-cleavage (corta reporter fluorescente) após reconhecimento alvo.
• Combina especificidade CRISPR + sensibilidade amplificação isotérmica (RPA/LAMP).
• Readout: faixa lateral (lateral flow), fluorescência portátil, smartphone.
• Multiplexação (vários alvos + controles em uma reação).