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Método de Ensaio de Placas (Plaque Assay) para Vírus

Factos

Um ensaio é uma técnica para isolar e purificar vírus e determinar títulos virais (menor concentração que resulta em infeção). O ensaio de placas, originalmente chamado ensaio virológico, foi desenvolvido para medir e contar a infectividade de bacteriófagos, sendo depois aplicado a vírus de mamíferos.

Uma placa é uma cultura monolítica confluente de células. Forma-se pela infeção de uma célula por uma única partícula viral. Uma vez infetada, o vírus replica e mata a célula; partículas recém-replicadas espalham-se, infetam e matam células vizinhas.

Função

No ensaio de placas, a cultura é corada com corante específico que tinge apenas células viáveis (vivas). Células mortas aparecem não coradas contra o fundo tingido. Atualmente, o ensaio é aplicado para detetar células que produzem anticorpos que destroem eritrócitos por hemólise.

Características

Eritrócitos (glóbulos vermelhos) contêm hemoglobina e transportam oxigénio e dióxido de carbono. Hemólise ocorre quando eritrócitos se rompem e libertam hemoglobina. No ensaio, placas claras indicam que eritrócitos foram hemolisados pelos anticorpos.

Método - Parte I

Preparam-se diluições seriadas de 10 vezes de um stock viral e colocam-se alíquotas de 0,1 mL em monocamadas celulares. Incuba-se para o vírus atacar as células. As monocamadas são cobertas por meio nutritivo contendo substância gelificante (geralmente ágar). O gel restringe a propagação viral às células circundantes, e cada partícula infecciosa produz uma zona circular — uma placa. Com o tempo, a placa cresce até tamanho visível a olho nu; corantes melhoram a visualização.

Método - Parte II

O título viral é calculado em unidades formadoras de placas (PFU) por mililitro. Contam-se apenas placas com 10 a 100 placas para minimizar erro. Segundo "Detecting Viruses: A Plaque Assay" (Vincent Racaniello), para cada 100 placas contadas, o mesmo título varia ±10%. O erro estimado do ensaio é ~10%, quando realizado corretamente.