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Como Fazer Diluições de Anticorpos para Imuno-histoquímica (IHC)

Introdução

A imuno-histoquímica (IHC) é uma técnica especializada usada por cientistas para visualizar células dentro de tecidos que foram colocados em lâmina e corados com um anticorpo apropriado que reconhece uma proteína única da célula ou tecido sob investigação. As diluições de anticorpos (titulações) devem ser realizadas usando as condições experimentais especificadas no próprio protocolo do usuário, não o do fabricante do anticorpo, pois os dois podem não ser idênticos.

Materiais Necessários

• Células para coloração
• Anticorpo
• Buffer de diluição ("diluente")
• Pipetas e ponteiras
• Tubo microfuga
• Papel alumínio
• Marcadores de laboratório e etiquetas para tubos
• Gelo
• Caixa para lâminas protegida da luz

Instruções

1. Verificar e Preparar o Anticorpo

Verifique se o anticorpo foi produzido no hospedeiro correto e reage com a versão exata da proteína (conhecida como isoforma ou variante de splicing) que está sendo testada. Usando uma pipeta, retire cuidadosamente uma porção de 10 microlitros e rotule como "estoque pessoal".

Se apenas volumes muito pequenos de anticorpo estiverem disponíveis, pule esta etapa.

Manter um estoque pessoal de anticorpo é prática rotineira em todos os laboratórios, pois evita contaminação cruzada do estoque original. Dispense em um tubo microfuga protegido da luz, ou em um tubo microfuga normal envolto em papel alumínio para proteger da luz direta.

Mantenha este tubo no gelo, preferencialmente em uma caixa térmica com tampa hermética, novamente para minimizar a luz, que pode destruir o anticorpo. Anote a concentração do estoque original (ex: 100 Unidades por mililitro, 1 miligrama por microlitro, etc.) no tubo, incluindo o nome do anticorpo e em qual buffer está diluído (ex: soro, salina, água, etc.).

2. Preparar o Buffer de Diluição

Prepare o buffer de diluição, também conhecido como diluente do anticorpo. Verifique se é compatível com o anticorpo e o procedimento de imuno-histoquímica usado, por exemplo, não deve obscurecer fluorescência ou inibir marcação subsequente com anticorpo secundário. Prepare uma diluição padrão de imuno-histoquímica (também o buffer de bloqueio) misturando fosfato salino tamponado 1X com 1% Triton-X100, 10% soro fetal bovino e 0,2% azida de sódio.

3. Titular o Anticorpo

Com a concentração dada do anticorpo no estoque pessoal (expressa em unidades de concentração como micrograma por microlitro), determine o volume de anticorpo necessário para obter 10 microgramas de anticorpo.

Monte uma série de diluições pipetando um volume equivalente a 2 microgramas de anticorpo (ex: X microlitros) em 100 microlitros de diluente e misture bem pipetando para cima e para baixo. A partir desta diluição inicial, retire os mesmos X microlitros e adicione a 100 microlitros subsequentes de diluente. Repita até obter 8-10 diluições (ou uma série).

O último tubo terá a menor concentração e será a concentração "saturante" que gerará o maior nível de sinal durante o experimento. No entanto, a concentração ideal será ligeiramente mais concentrada que esta, para que não seja produzido sinal excessivo, o que pode causar erros de fundo.

Rotule os tubos corretamente com as novas concentrações diluídas.