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Protocolo de biotinilação de superfície celular

Biotinilação usa capacidade da biotina (vitamina solúvel) de ligar a proteínas celulares. Biotina liga à estreptavidina, útil em biologia celular para visualizar proteínas. Permite marcação segura comparada a radioatividade e não afeta função normal da célula. Permite estudo de receptores, maior compreensão de doenças e processos.

Marcação de células em suspensão

Lave células em PBS gelada para remover contaminantes. Tampões com tris e glicina competem com biotinilação — evite. Para evitar biotinilação de proteínas internas, realize a 4°C ou com azida. Ressuspenda em PBS e biotina solúvel (sulfo-NHS-LC-biotina).

Marcação de células aderentes

Lave em PBS e incube com sulfo-NHS-LC-biotina. Raspe células em prato e lise em tampão com detergente Triton X-100 para visualização.

Preparação de células marcadas

Após incubação, centrifuge em pellet, lave em PBS. Ressuspenda em PBS e purifique com gel de sefarose IgG. Proteína ligada diluída em tampão de carregamento e aquecida a 100°C.

Visualização

Proteínas diluídas visualizadas por eletroforese SDS-PAGE seguida de blotting com mistura proteína/enzima estreptavidina-peroxidase. Blots visualizados por quimioluminescência (emissão de luz). Especificidade confirmada com anticorpos para proteína em estudo.