Biotinilação da superfície celular protocolo

biotinilação utiliza a capacidade da vitamina solúvel biotina ligar-se a proteínas da célula . A biotina liga-se à proteína estreptavidina e é , por conseguinte , úteis na biologia da célula para visualizar as proteínas celulares . Biotinilação permite a rotulagem segura de proteínas em relação a técnicas tais como a radioactividade e não afecta a função normal da célula . Ele permite aos pesquisadores estudar as proteínas celulares , tais como receptores , e que permite uma maior compreensão das doenças e processos de doença. Rotulagem Suspenso Células

Lave as células de fosfato gelada solução salina tamponada (PBS) para remover os contaminantes . Tampões contendo tris- glicina e vai competir com biotinilação e deve ser evitada . Para evitar a biotinilação de proteínas internas , a etiquetagem pode ser realizada a 4 graus Celsius , ou na presença de azida . Ressuspender as células em PBS ea biotina solúvel , sulfo -NHS -LC- biotina .

Labeling aderentes Células

Lave as células em PBS e incubar com um produto, tais como sulfo - NHS - LC - biotina . As células são então raspadas para um prato e lisadas num tampão contendo detergente Triton X - 100 e preparado para visualização .
Preparar células marcadas

Seguindo de incubação , as células são centrifugadas numa pelete e lavadas em PBS . As células são novamente suspensas em PBS e purificado com gel a IgG -Sepharose . A proteína ligada é diluída em tampão de carga e aqueceu-se a 100 graus Celsius .
Visualizando Células

proteínas diluído pode ser visualizada utilizando electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio ( SDS - PAGE ) seguido de mata-borrão com a proteína e mistura de enzima , peróxido de estreptavidina de rábano . As membranas são visualizados com uma reação química --- quimiluminescência --- que emite luz . Especificidade do biotinilaï pode ser confirmado com anticorpos para a proteína em estudo.