Como detectar NADH

nicotinamida adenina dinuceltoide (NADH ) , abreviado " NAD " , é uma coenzima encontrada em células vivas , que produz reações químicas em proteínas. As empresas farmacêuticas estudar NADH por causa de seu processo de metabolismo, e sinteticamente criá-lo para uma série de propósitos. Desde NADH é microscópico , a olho nu não pode detectá-lo . Você precisa de testes científicos e um kit de ensaio para detectar a sua presença . Coisas que você precisa de gelo seco

Micro- centrífuga Eppendorf
tubos
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Reagente de Reconstituição
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definir o buffer ciclismo em um contador e permitir que o tampão para alcançar a temperatura ambiente . A temperatura ideal para o buffer é de 22 graus Celsius.
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Reconstituir a mistura de enzimas ciclismo NAD com exatamente 220 microlitros de tampão de ciclismo. Congelar a solução em temperaturas abaixo de -70 graus Celsius.
3

Reconstituir o desenvolvedor NADH com 1,2 ml de ddH2O . Misturar suavemente a solução , até que esteja completamente dissolvido . Não vórtice.
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padrão Reconstituir NADH com 200 microlitros de puro dimetilsulfóxido .
Preparação de amostras
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Lavar as células com tampão fosfato .
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Pellet 2x10 ( 5 ) células para cada ensaio em um tubo de micro- centrífuga e executar a 2.000 RPM por 5 minutos .
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extrair as células com 400 microlitros de tampão de extracção de NAD /NADH pela congelação e descongelação das células em dois ciclos - 20 minutos em gelo seco e 10 minutos à temperatura ambiente . Vortex o extraíram células por exatamente 10 segundos.
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Gire as amostras de células em um micro- centrífuga a 14.000 RPM por exatamente 5 minutos.
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Transfira o NAD /NADH células em um tubo limpo.
Assay Protocolo
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Diluir 10 microlitros da norma NADH com 990 microlitros de tampão de extração NAD /NADH. Adicionar 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 microlitros da solução diluída para uma placa de 96 poços em duplicado para criar 0 , 20 , 40 , 60 80 , 100 poços padrão . Encher o último poço com 50 microlitros do tampão de extracção de NAD /NADH .
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Transferência 50 microlitros das amostras de células extraídas para dentro de uma placa de 96 poços em duplicado como antes .
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Preparar as amostras de células para a detecção de NADH . Decompõe-se o NAD a partir das amostras de células colocando 200 microlitros das amostras de células extraídas para tubos eppendorf . Aqueça os tubos a 60 graus celsius por exatamente 30 minutos em banho-maria com temperatura controlada . Arrefecer rapidamente as amostras , colocando os tubos em gelo . Gire as amostras no micro- centrífuga para remover precipitados . Transferência de 50 microlitros das amostras decompostas em uma placa de 96 poços em duplicado como antes .
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Misturar a mistura tampão de ciclismo NAD com 100 microlitros de tampão de NAD mistura ciclismo e 2 microlitros de enzima NAD ciclismo . Adicionam-se 100 microlitros desta nova solução para cada poço de padrões e amostras de NADH .
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Incubar a placa à temperatura ambiente durante exactamente 5 minutos. Este processo irá converter o NAD a NADH.
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Adicionar 10 microlitros de desenvolvedor NADH em todos os poços. Deixar a placa descansar em temperatura ambiente por no mínimo 1 hora e no máximo 4 horas.
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Leia a placa e calcular o NADH.