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Como Detectar NADH

Detecção Laboratorial de NADH (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzido)

NADH (abreviado NAD) é coenzima em células vivas que produz reações químicas em proteínas. Empresas farmacêuticas estudam seu metabolismo e o sintetizam para diversos fins. Por ser microscópico, olho nu não o detecta. Necessário teste científico e kit de ensaio.

Materiais Necessários

• Gelo seco
• Microcentrífuga
• Tubos Eppendorf

Protocolo de Ensaio

Reconstituição de Reagentes

1. Deixe buffer de ciclagem em temperatura ambiente (ideal: 22°C).
2. Reconstitua mistura enzimática de ciclagem NAD com 220 µL de buffer. Congele abaixo de -70°C.
3. Reconstitua revelador NADH com 1,2 mL de ddH2O. Misture suavemente até dissolver. Não use vortex.
4. Reconstitua padrão NADH com 200 µL de dimetil sulfóxido puro.

Preparação da Amostra

5. Lave células com salina fosfatada tamponada.
6. Pellet 2x10⁵ células por ensaio em tubo de microcentrífuga, 2.000 RPM por 5 min.
7. Extraia células com 400 µL de buffer de extração NAD/NADH: 2 ciclos congelamento/descongelamento (20 min gelo seco, 10 min temp. ambiente). Vortex 10 seg.
8. Centrifugue amostras a 14.000 RPM por 5 min.
9. Transfira células NAD/NADH para tubo limpo.

Protocolo de Ensaio para Detecção de NADH

10. Diluir 10 µL padrão NADH com 990 µL buffer extração. Adicionar 0, 2, 4, 6, 8, 10 µL em placa 96 poços (duplicata) para criar padrões 0, 20, 40, 60, 80, 100. Último poço: 50 µL buffer.
11. Transferir 50 µL amostras extraídas para placa 96 poços (duplicata).
12. Preparar amostras para detecção NADH: decompor NAD colocando 200 µL amostras em tubos Eppendorf. Aquecer 60°C por 30 min em banho termostatizado. Resfriar rapidamente no gelo. Centrifugar para remover precipitados. Transferir 50 µL amostras decompostas para placa (duplicata).
13. Misturar buffer ciclagem NAD (100 µL) com enzima ciclagem (2 µL). Adicionar 100 µL em cada poço de padrões e amostras.
14. Incubar placa em temp. ambiente por 5 min (converte NAD em NADH).
15. Adicionar 10 µL revelador NADH em cada poço. Deixar em temp. ambiente 1-4 horas.
16. Ler placa e calcular NADH.