N sequenciação do terminal protocolo

degradação de Edman - um processo bem conhecido para a identificação do aminoácido N -terminal de uma proteína - requer a clivagem do aminoácido , seguido de identificação utilizando cromatografia ou electroforese . Os processos automatizados acelerar seqüenciamento N -terminal. Os fatos

proteínas produzidas dentro das células individuais agem como hormônios, enzimas e outros importantes reguladores . Mutação genética que resulta em uma proteína anormal pode ter graves consequências para a saúde .
Processo

O aminoácido N -terminal é clivado por tratamento com um dos vários reagentes , em seguida, hidrolisado para formar um aminoácido em separado . A cromatografia em camada fina , HPLC ou electroforese determina o tamanho do aminoácido , e compara-a com um padrão de tamanho conhecido . A nova extremidade N -terminal da proteína restante pode ser semelhante clivada para identificação.

Automação

Applied Biosystems liderou o desenvolvimento de automação de degradação de Edman , que se liga uma proteína purificada a uma membrana e trata -lo com fenilisotiocianato . O aminoácido livre injetado automaticamente em um sistema de HPLC para identificação.
Complicações

Proteínas devem permanecer relativamente pura e livre de contaminantes para determinar com precisão o aminoácido N -terminal . Limites de degradação de Edman requerem grandes moléculas de proteína fragmentadas em pequenas cadeias peptídicas não mais de 50 aminoácidos .