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Preparação de Placas de Agar com Cloranfenicol: Protocolo de Laboratório

Visão Geral

O cloranfenicol é um antibiótico de amplo espectro que inibe a síntese proteica bacteriana. Devido a efeitos adversos graves (anemia aplástica, supressão medular), seu uso clínico é restrito a último recurso. Em pesquisa, é amplamente empregado em placas de seleção para isolamento de bactérias com plasmídeos de resistência ao cloranfenicol (gene cat).

Materiais Necessários

• Água destilada
• Cloranfenicol (pó ou solução estoque 25 mg/mL em etanol 95%)
• Triptona 1,0% (10 g/L)
• Extrato de levedura 0,5% (5 g/L)
• Cloreto de sódio (NaCl) 1,0% (10 g/L), pH 7,0
• Ágar 1,5% (15 g/L)
• Etanol 95%
• Erlenmeyer de 2 L
• Placa de agitação magnética + barra magnética
• Luvas de látex ou nitrilo
• Balança analítica
• Autoclave
• 30 placas de Petri estéreis (10 cm)
• Caneta marcadora azul
• Parafilm, papel-alumínio, fita de autoclave

Protocolo Passo a Passo

1. Prepare o caldo LB: Pese 10 g triptona, 5 g extrato de levedura, 10 g NaCl e 15 g ágar. Transfira para o erlenmeyer usando papel de pesar como funil.
2. Dissolva: Adicione água destilada até 1 L. Coloque a barra magnética, agite em velocidade moderada até dissolução completa.
3. Proteja: Cubra com Parafilm, papel-alumínio e fita de autoclave.
4. Esterilize: Autoclave a 121°C, 15 psi, ciclo líquido, 20 min.
5. Resfrie: Deixe atingir ~55°C (banho-maria a 65°C ou temperatura ambiente).
6. Asepsia: Pulverize bancada com etanol 95%. Troque luvas.
7. Identifique: Marque lateral e tampa das placas com faixa vertical azul (padrão: LB + cloranfenicol).
8. Adicione o antibiótico: Para concentração final de 100 µg/mL, adicione 1 mL de estoque 25 mg/mL por litro de meio. Homogeneize (agitação magnética 1-2 min ou movimento circular).
9. Distribua: Flameje a boca do frasco, despeje ~15-20 mL/placa (meia altura). Deixe solidificar.
10. Armazene: Vire as placas (tampa para baixo), guarde a 4°C. Validade: ~4 semanas.

Notas Importantes

• Cloranfenicol é termolábil: nunca adicione antes da autoclavação.
• Trabalhe próximo ao bico de Bunsen ou em capela de fluxo laminar.
• Descarte resíduos conforme normas de biossegurança.