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Protocolo de Inclusão em Parafina

Introdução

Cientistas geralmente precisam solidificar amostras biológicas para seccioná-las. Isso facilita para cientistas adicionar corantes, anticorpos e sondas à amostra biológica. Também reduz a sobreposição de várias camadas celulares. Cientistas usam cera de parafina como matriz dura para o corte, já que a parafina não se mistura com água. Parafina é um tipo de hidrocarboneto. As amostras biológicas contêm água, então os cientistas devem desidratar as amostras usando banhos de etanol cada vez mais concentrados.

Xileno

Cientistas removem o etanol usando xileno. Então usam cera de parafina derretida para remover o xileno. Para microscopia de luz, as seções de parafina geralmente têm 5 µm de espessura. Cera de parafina não é dura o suficiente para fatias mais finas. Cientistas reidratam o tecido usando xileno primeiro, depois etanol. Então enxaguam a amostra biológica com água destilada para evitar contaminação.

Fixação

Tecidos incluídos em parafina são geralmente fixados usando formalina tamponada neutra, que é a versão comercial do formaldeído. Isso inclui paraformaldeído e metanol, que impede o formaldeído de converter em ácido fórmico. Tecidos fatiados finamente precisam de 48 horas de fixação em temperatura ambiente para histologia ideal, que é o estudo da anatomia microscópica. Caso contrário, o tecido endurecerá e se tornará quebradiço. Antes do processamento, o tecido é geralmente armazenado em etanol a 70% a uma temperatura de 4°C.

Processadores de Parafina

Cientistas frequentemente usam processadores de parafina para enviar o tecido através de banhos que desidratam gradualmente o material antes que a parafina quente possa entrar através dos tecidos. Cientistas rodam o processador durante a noite. O processador apenas aquece o tecido por um certo período dependente do tecido para garantir que não fique duro e quebradiço. O processador usa vácuo que acelera a permeação da parafina e remove bolhas de ar. Uma vez processados, os tecidos são armazenados em cassetes em temperatura ambiente.

Derretimento da Cera

A parafina derrete por uma hora antes de adicionar o tecido. O cassete inteiro é colocado em um banho de parafina a 65°C por 15 minutos. Um dissipador de calor de alumínio frio resfria a cera de parafina por 20 minutos. Quando a cera racha ou os tecidos não estão alinhados corretamente, o cientista derrete a parafina e repete o processo.

Corte

Ao seccionar os tecidos, o cientista aquece o banho de água a 35-37°C. A água é fresca e desionizada. Os blocos são colocados com a face para baixo em um bloco de gelo ou dissipador de calor por 10 minutos. Uma lâmina corta o bloco em seções. Dois problemas que podem ocorrer são fita ruim e espécimes fragmentados. Quando os espécimes fragmentam, a água está muito quente. Se o bloco não forma fita bem, você deve colocá-lo de volta no bloco de gelo e firmar a cera antes de recomeçar.