Protocolo de Co-Imunoprecipitação (Co-IP): Análise de Interação Proteína-Proteína

Princípio

Co-IP = técnica padrão para estudar interações proteína-proteína in vivo. Três etapas principais:

Anticorpo específico adicionado ao lisado celular → forma complexo anticorpo-proteína alvo.
Protein A/G Sepharose (ou beads magnéticas) liga-se à região Fc do anticorpo → precipita o complexo.
Eluição + identificação: Western blot (anticorpo contra proteína parceira) ou espectrometria de massa / sequenciamento de banda purificada.

Preparação: cultura, lise em buffer não desnaturante (ex.: NP-40, Triton X-100), pré-clarificação (centrifugação).
Incubação: anticorpo (2–4h a 4°C ou overnight) + beads (1–2h).
Lavagens: 3–5x com buffer de lise (baixo detergente) → remove inespecíficos.
Eluição: buffer de Laemmli + calor (SDS-PAGE) ou eluição ácida (para MS).
Análise: Western blot ou MS.

Controle negativo: IgG isotípico não relacionado (mesma espécie/subclasse).
Controle de input: 1–5% do lisado total para confirmar expressão.
Escolha beads: Protein A (IgG coelho, porco, gato) vs Protein G (IgG rato, humano, cabra) — ou mistura A/G.
Buffer de lise: 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1% NP-40, inibidores de protease/fosfatase. Evite SDS (desnatura).
Pré-limpeza (pre-clearing): incubar lisado com beads sem anticorpo → remove proteínas que ligam beads inespecificamente.

Problema	Possíveis causas / soluções
Sem banda no Western	Anticorpo ruim (teste IP-grade), proteína de baixa abundância (aumente input), epítopo mascarado (tente outro Ab), interação fraca/transitória (crosslinker: DSP, formaldehyde).
Muitas bandas inespecíficas	Aumente lavagens (sal/detergente), use beads pré-bloqueados (BSA 5%), reduza quantidade de Ab.
Proteína alvo não precipita	Verifique expressão no input; anticorpo reconhece forma nativa?; lisado muito stringente.
Fragmentos de anticorpo (25/50 kDa) atrapalham	Use anticorpo conjugado diretamente a beads ou beads com Protein A/G covalente; ou detecte com anti-leve chain específico.

Co-IP bem-sucedido = anticorpo validado + controles rigorosos + otimização de buffer/lavagens.