O principal hormônio sexual masculino, a testosterona, é primariamente produzida nos testículos (glândulas reprodutivas masculinas localizadas no escroto). Especificamente, as células de Leydig (células intersticiais) dentro dos testículos sintetizam e secretam testosterona em resposta ao hormônio luteinizante (LH) da hipófise anterior.
Uma pequena quantidade, mas fisiologicamente relevante (~5–10%) também é produzida no córtex adrenal (zona reticularis) como andrógenos fracos (DHEA, androstenediona) que podem ser convertidos em testosterona periféricamente. Em mulheres, os ovários e glândulas adrenais produzem testosterona em quantidades muito menores.
A produção de testosterona é regulada pelo eixo hipotálamo-hipófise-gônada (HPG): GnRH → LH/FSH → testosterona das células de Leydig → feedback negativo para hipotálamo/hipófise.