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Como Fazer um Mapa de Restrição (Restriction Mapping)

Contexto Histórico e Atual

Nos primórdios da biologia molecular, cientistas usavam mapeamento de restrição para entender genes estudados. Em laboratórios modernos, largamente ultrapassado porque sequenciamento tornou-se mais disponível e econômico. Porém, há casos onde mapa de restrição pode ser adequado para investigações. Abordagem geral: uso de enzimas de restrição (digestivas) para quebrar fisicamente amostra de DNA. Medindo produtos dessa digestão, pode-se "reconstituir" pedaços e deduzir sequência original do DNA.

O que Você Vai Precisar

• Enzimas de restrição
• Amostra de DNA
• Solução tampão
• Gelo e banho-maria quente
• Equipamento de eletroforese em gel

Instruções

Digestão do DNA

1. Adicione enzima de restrição à amostra de DNA. Use EcoR1, enzima comum.
2. Adicione mistura a solução tampão (local da reação).
3. Aumente temperatura da reação conforme manual New England BioLabs. Cada enzima tem temperatura específica de reação ideal. Cada enzima tem sequência nucleotídica específica alvo. EcoRI corta DNA na sequência CAATTC. Ordem exata deve existir para enzima ligar e cortar. Até este ponto, todos materiais em gelo para evitar atividade indesejada.
4. Após reação conforme manual, rode mistura em eletroforese em gel para separar fragmentos de DNA por tamanho. Menores fragmentos movem-se mais longe no gel.
5. Meça distância percorrida por cada fragmento. Repita 5 passos com múltiplas enzimas diferentes separadamente.

Construindo o Mapa de Restrição

6. Usando dados do gel, colete toda informação encontrada com diferentes enzimas de restrição.
7. Deduza ordem dos sítios de restrição comparando comprimentos de fragmentos produzidos por cada enzima. Ex: enzima #1 produziu 2 fragmentos iguais; enzima #2 produziu 3 fragmentos iguais → enzima #1 corta no meio do DNA; enzima #2 corta em terços.
8. Usando conclusões do passo 2, monte ordem dos sítios de restrição para o DNA.