Citometria de Fluxo: Princípios, Aplicações e Análise de Dados

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Citometria de Fluxo: Princípios, Aplicações e Análise de Dados

A citometria de fluxo mede simultaneamente múltiplos parâmetros físicos e fluorescentes em células individuais em suspensão, em alto rendimento (10.000–50.000 eventos/seg).

Princípios Fundamentais

Foco Hidrodinâmico: Núcleo da amostra centralizado no fluido de bainha → interrogação em arquivo único.
Espalhamento de Luz: FSC (espalhamento frontal ≈ tamanho), SSC (espalhamento lateral ≈ granularidade/complexidade).
Fluorescência: Anticorpos conjugados a fluorocromos se ligam a antígenos-alvo; lasers excitam; detectores capturam emissão (filtros de passagem de banda).
Compensação: Correção de sobreposição espectral entre fluorocromos.
Gating: Plots sequenciais isolam populações de interesse (ex: linfócitos → singlets → CD3+ → CD4/CD8).

Aplicações Principais

Área	Usos
Imunofenotipagem	Subconjuntos de linfócitos (T/B/NK), marcadores de ativação, Tregs, exaustão (PD-1, TIM-3)
Malignidades Hematológicas	Diagnóstico de leucemia/linfoma (marcadores CD), MRD (10⁻⁴–10⁻⁶), atribuição de linhagem
Ciclo Celular / Proliferação	Ki-67, DAPI/PI, BrdU/EdU — fração S/G2/M
Apoptose	Annexin V / 7-AAD ou PI — apoptose precoce/tardia
Funcional	Captura de citocinas (ICS), fosfo-fluxo (pSTAT, pERK), fluxo de cálcio, ROS, potencial mitocondrial
Separação Celular (FACS)	Isolamento de alta pureza para genômica, cultura, transplante

Avanços Modernos

Citometria espectral (40+ parâmetros, desmistura de autofluorescência)
Citometria de massa (CyTOF) — anticorpos marcados com metal, 40+ parâmetros, sem sobreposição espectral
Citometria de fluxo de imagem (morfologia + fluorescência)
Multiômica de célula única (CITE-seq, REAP-seq: proteína de superfície + transcriptoma)

Controle de Qualidade

Contas de QC diárias (alinhamento, sensibilidade, estabilidade de fluorescência)
Padronização: EuroFlow, ICCS, painéis CYTOF.
Biossegurança: BSL-2 para amostras humanas não fixadas; fixação para envio.