Como executar um ELISA Ensaio

Um ELISA , ou um ensaio imunossorvente ligado a enzima , é uma técnica de laboratório bioquímico feito para detectar um antigénio ( tal como uma proteína ) ou anticorpo numa amostra experimental . O ensaio tira vantagem da ligação anticorpo - antigénio e podem ser usados para ensaiar as outras células e mecanismos de ligação molecular bem . Em um ensaio ELISA à base de proteínas , a " capturar " anticorpo ou proteína é previsto em um prato de ensaio e permitiu a aderir ao prato , após o qual a "sonda" agente (como uma proteína de interesse) é estabelecido e incubadas com o agente de captura. Após várias lavagens , uma " detecção " anticorpo é adicionado de modo a visualizar a presença ou ausência de anticorpo - antigénio ou proteína - proteína de ligação . O que você precisa
Ensaio prato ( por exemplo , de 96 poços de bloco )
captura de anticorpo ( diluído para 5 ug /mL em NaHCO2 50 mM , pH 9,6 )
Sonda anticorpo /proteína (diluído a várias concentrações )
anticorpo de detecção ( por exemplo , peroxidase de rábano silvestre acoplado a anticorpo )
tampão PT ( 1x PBS , 0,05 por cento de Tween - 20 )
tampão ( PBS 1x bloqueio com 5 mg /mL de BSA , ou 5 por cento leite desnatado em 1x PBS)
reagente de detecção ( ou seja, mistura reagente TMB)
agitador de laboratório
sala fria ou geladeira
pipeta e dicas de
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Diluir o anticorpo de captura a 5 ug /ml em NaHCO2 50 mM (pH 9,6 ) . Adicionar 50 uL de cada poço da placa de amostra utilizada para testes . Cubra com plástico ou de alumínio e incuba-se durante a noite a 4 graus C num agitador .
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Despejar anticorpo de captura e lavar duas vezes com 200 uL de tampão PT. Adicionar 200 uL de tampão de bloqueio por poço ( leite desnatado PB ou 5 por cento ) . Incubar em qualquer lugar a partir de duas horas a noite , agitando a 4 graus C.
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Despejar tampão de bloqueio e lavar 4 vezes com 200 uL de tampão PT. Adicionar "sonda" amostras de proteínas em várias concentrações em PB ou 5 por cento de leite desnatado , adicionando 100 uL por poço . Incubar uma hora balançando a 4 graus C. Despejar soluções sonda e lavar seis vezes com 200 uL de tampão PT.
4

Adicionar anticorpo de detecção (anticorpo HRP- conjugado) diluído 1:4000 em tampão PB ou 5 por cento de leite desnatado ( ou um contendo 0,05 por cento de Tween - 20 ) , a adição de 50 uL por poço de amostra . Incubar durante 30 minutos a uma hora , agitação, a 4 graus C.
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Despejar solução de anticorpo de detecção e lavar 6 vezes com 200 uL de tampão PT por cavidade , seguido por lavagem duas vezes com 200 ul de 1x PBS ( solução salina tamponada com fosfato ) . Despejar PBS e adiciona-se 100 uL de reagente de detecção, por poço ( para HRP , utilize o reagente TMB recém - misturado através da mistura de substrato TMB e de peróxido de 1:1) . Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente, agitando de vez em quando.

Quando usando TMB e HRP : Finalmente , adiciona-se 100 uL de H3PO4 1M ( ácido fosfórico ) por cavidade , a fim de extinguir a reacção de TBM

Leia placa usando o leitor de análise de amostras , tais como um leitor de placas de 96 poços . . (Para HRP e TMB , use o modelo " ELISA End -Point Ensaio ", disponível na maioria dos leitores. )