Como realizar um ensaio ELISA

O ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática) é uma técnica bioquímica de laboratório usada para detectar um antígeno (como uma proteína) ou anticorpo em uma amostra experimental. O método aproveita a ligação anticorpo-antígeno e pode ser adaptado para estudar outros mecanismos de ligação celular e molecular.

Num ELISA baseado em proteínas, um anticorpo ou proteína "captura" é imobilizado nos poços de uma placa de ensaio e incubado para aderir. Em seguida, adiciona-se o agente "sonda" (a proteína de interesse) e incuba-se com o agente de captura. Após várias lavagens, adiciona-se um anticorpo "detector" para visualizar a presença ou ausência de ligação anticorpo-antígeno ou proteína-proteína.

Materiais necessários

• Placa de ensaio (ex.: bloco de 96 poços)
• Anticorpo de captura (diluído a 5 µg/mL em 50 mM NaHCO₃, pH 9,6)
• Anticorpo/proteína sonda (diluído em várias concentrações)
• Anticorpo detector (ex.: anticorpo conjugado à peroxidase de raiz-forte)
• Tampon PT (1x PBS, 0,05% Tween-20)
• Tampon de bloqueio (1x PBS com 5 mg/mL BSA ou 5% leite desnatado em 1x PBS)
• Reagente de detecção (ex.: mistura de reagente TMB)
• Agitador mecânico de laboratório
• Câmara fria ou refrigerador
• Pipetador e pontas

Procedimento

1. Imobilização do anticorpo de captura: Diluir a 5 µg/mL em 50 mM NaHCO₃ (pH 9,6). Adicionar 50 µL por poço. Cobrir com filme plástico ou alumínio e incubar overnight a 4 °C sob agitação.
2. Bloqueio: Descartar o anticorpo de captura e lavar duas vezes com 200 µL de tampon PT. Adicionar 200 µL de tampon de bloqueio por poço (PBS ou 5% leite desnatado). Incubar de 2 horas a overnight a 4 °C com agitação.
3. Incubação com a sonda: Descartar o tampon de bloqueio e lavar 4 vezes com 200 µL de tampon PT. Adicionar amostras da proteína sonda em várias concentrações (em PBS ou 5% leite desnatado), 100 µL por poço. Incubar 1 hora a 4 °C com agitação. Descartar e lavar 6 vezes com 200 µL de tampon PT.
4. Adição do anticorpo detector: Adicionar anticorpo detector (conjugado a HRP) diluído 1:4000 em tampon PBS ou 5% leite desnatado (com 0,05% Tween-20), 50 µL por poço. Incubar 30 min a 1 hora a 4 °C com agitação.
5. Detecção e leitura: Descartar solução do anticorpo detector e lavar 6 vezes com 200 µL de tampon PT, seguido de 2 lavagens com 200 µL de 1x PBS. Descartar PBS e adicionar 100 µL de reagente de detecção por poço (para HRP, usar TMB fresco misturando substrato TMB e peróxido 1:1). Incubar 15 min à temperatura ambiente com agitação ocasional. Ao usar TMB e HRP: adicionar 100 µL de H₃PO₄ 1M por poço para parar a reação. Ler a placa em leitora de ELISA (ex.: leitora de 96 poços, usando o template "ELISA End-Point Assay").