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Protocolo de Western Blot: Transferência, Ligação de Anticorpo e Detecção de Proteína

Western blot é técnica consagrada para identificar proteínas específicas isoladas de tecido. Proteínas separadas por carga e peso em gel SDS-Poliacrilamida e transferidas para membrana de nitrocelulose. Após transferência, anticorpos marcados ligam-se especificamente à proteína desejada e são fotografados com filme de raio-X ou visualizados por coloração específica. Resultado final: bandas escuras indicando presença da proteína identificada. Artigo foca na metodologia básica para laboratório qualificado em pesquisa complexa de proteínas.

Materiais Necessários

• Gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) com proteínas separadas
• Membrana de nitrocelulose
• Água destilada
• Buffer de transferência (30 g Tris, 144 g Glicina, 200 ml metanol em 1 L água)
• Papel filtro Whatman 3 mm
• Esponja de laboratório
• Câmara de transferência Western blot
• Fonte de alimentação de laboratório
• Refrigerador de laboratório
• Agitador de laboratório
• Solução TBS (24,2 g Tris Base, 80 g NaCl em 1 L água)
• Solução de bloqueio (5% leite em pó desnatado em TBS)
• Solução de anticorpo primário
• Solução de anticorpo conjugado marcado
• Solução substrato fosfatase alcalina com nitro blue tetrazolium
• Salina fosfatada tamponada (PBS)
• Caixa de imagem de gel (gel-imager)

Transferência de Proteínas para Membrana de Nitrocelulose

1. Prepare a membrana: Mergulhe em água destilada 2 min, depois em buffer de transferência 5 min.
2. Monte "sanduíche": Esponja / papel filtro / SDS-PAGE / nitrocelulose / papel filtro / esponja. Alinhado: membrana mais próxima ao ânodo, gel mais próximo ao cátodo dentro da câmara.
3. Adicione buffer na câmara: Submerja sanduíche. Coloque câmara no refrigerador. Transferência a 4°C.
4. Configure fonte de alimentação: Direção ânodo (cabo vermelho). Proteínas maiores migram mais rápido. Fonte controla taxa. 30 V e 40 mA para transferência overnight.
5. Desmonte após transferência: Não toque buffer nem remova sanduíche enquanto fonte conectada.
6. Incube membrana em solução de bloqueio 2h: Proteínas do bloqueio absorvem onde não há proteína — evita ligação inespecífica de anticorpo.

Ligação do Anticorpo

7. Incube com anticorpo primário (agitador): Membrana submersa ≥ 1h (overnight aceitável).
8. Lave bem: 4 lavagens de 10 min com TBS removem anticorpo não ligado.
9. Incube com anticorpo conjugado marcado (agitador): ≥ 1h. Conjugado ligado a fosfatase alcalina — enzima-anticorpo que reconhece e liga ao primeiro anticorpo.

Detecção da Proteína

10. Enxágue em PBS 10 min × 4: Remove resíduo do conjugado marcado.
11. Incube em substrato fosfatase alcalina até bandas aparecerem: Corante no substrato liga ao complexo anticorpo-antígeno-proteína na membrana → banda escura. Pode ser imediato ou até 30 min.
12. Embrulhe membrana em celofane e coloque no gel-imager: Visualiza resultados no filme/membrana.