Western Blot Instruções

análise Western blot é uma técnica bem conhecida para a identificação de proteínas específicas isoladas de tecido . As diferentes proteínas são primeiro separados por carga e peso em gel de SDS - poliacrilamida e transferidos para uma membrana de nitrocelulose . Após a transferência , os anticorpos etiquetados ligam-se especificamente com a proteína desejada e são fotografados usando um filme de raios X ou visualizado por coloração específica à proteína . O resultado final apresenta bandas escuras indicando a presença da proteína identificada . Este artigo enfoca a metodologia básica para a realização de análise de Western blot em um laboratório qualificado para pesquisa de proteínas complexas. Coisas que você precisa
gel de SDS-poliacrilamida (SDS- PAGE) com proteínas separadas
nitrocelulose membrana
água destilada
Transferência tampão ( 30 g de Tris , 144 g Glycine e 200 ml de metanol em 1 l água)
papel de filtro, Whatman
3 mm esponja Laboratório
blot câmara de transferência ocidental
Laboratório de alimentação
Laboratório geladeira
agitador Laboratório
solução Tris salina tamponada (TBS) ( 24,2 g de Tris base, 80 g de NaCl em 1 litro de água)
solução de bloqueio ( leite em pó desnatado de 5 por cento em TBS)
solução de anticorpo primário
solução de conjugado anticorpo marcado
Alkaline solução de substrato de fosfatase com azul nitro tetrazólio mancha
Solução tampão de fosfato (PBS)
caixa Gel- imager
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Transferência Proteínas de membrana de nitrocelulose
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Prepare a membrana de nitrocelulose. A membrana deve ser embebido em água destilada por dois minutos , em seguida, colocados no buffer de transferência e permitidos de molho por cinco minutos.
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Montar um sanduíche de transferência constituídos por papel esponja /filtro /SDS PAGE /papel membrana de nitrocelulose /filtro /esponja. A sanduíche é alinhado de modo que a membrana se encontra mais próxima do ânodo e do gel mais perto para o cátodo no interior da câmara de transferência .
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Adicionar tampão de transferência na câmara de modo a sanduíche é submerso . Coloque a câmara de dentro da geladeira de laboratório. Transferência de proteína a partir do gel para a membrana deve ser realizada a 4 graus Celsius .
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Defina -se a fonte de alimentação para transferir proteínas do gel para a membrana . A direção da transferência é em direção ao ânodo indicado pelo fio vermelho . Proteínas maiores movem-se mais rapidamente em resposta a uma corrente eléctrica e irá mover-se em primeiro lugar. A fonte de alimentação controla a taxa de transferência . Definir o poder de 30 V e 40 mA para uma transferência durante a noite.
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Desmonte o fornecimento de energia após a transferência estiver completa. Não faça contato com o buffer de transferência ou remover o sanduíche enquanto a fonte de alimentação está ligado .
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Retire a membrana do sanduíche e incubar por duas horas em solução de bloqueio . As proteínas na solução de bloqueio irá absorver na membrana em que não estão presentes proteínas . Isso vai impedir que qualquer anticorpo de ligação à membrana , onde a proteína desejada não está presente .
Ligar ao anticorpo
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Incubar a membrana de nitrocelulose com solução de anticorpo primário, utilizando um agitador. A membrana deve ser completamente submerso na solução durante pelo menos uma hora . É aceitável para incubar durante a noite .
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Lave a membrana completamente para remover os anticorpos não ligados . Quatro lavagens separadas de 10 minutos com TBS geralmente são suficientes para remover o excesso de anticorpos .
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Incubar a membrana numa solução de conjugado de anticorpo marcado utilizando o agitador . A membrana deve ser incubada durante um mínimo de uma hora. O conjugado de anticorpo marcado ligado a fosfatase alcalina . É a mistura de enzima - anticorpo que reconhecerá e ligar-se ao primeiro anticorpo .
Detecção da Proteína
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Lavar a membrana durante 10 minutos em PBS quatro vezes . Isto irá remover o restante do conjugado anticorpo marcado .
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Incubar a membrana em solução de substrato de fosfatase alcalina até padrões de bandas aparecem . O corante na solução de substrato irá ligar-se ao antigénio - anticorpo - proteína na membrana e formar uma banda de cor escura . O processo pode ser imediata ou demorar até 30 minutos antes de as bandas são observadas .
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Enrole a membrana completamente em papel celofane e coloque-o diretamente sobre o gel - imager para visualizar os resultados . O gel - sensor é capaz de fotografar os resultados exibidos na membrana de Western Blot.