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Técnicas de Análise de DNA Desenvolvidas desde 1985: PCR, Sequenciamento, Tempo Real, Microarrays e Nova Geração

Pesquisa genética é uma das disciplinas científicas de evolução mais rápida. Tecnologia inicial usava marcadores radioativos para sequenciamento de DNA, identificação de bases individuais. DNA é o projeto de todo organismo vivo, inclusive vírus. Formado por milhões/bilhões de unidades repetidas de quatro bases nitrogenadas: A (adenosina), G (guanosina), C (citosina), T (timina). Humanos têm ~9 bilhões de bases, repetidas sem padrão distinto. Três bases codificam um aminoácido. Cadeia de aminoácidos determina uma proteína. O conjunto de proteínas define as características do organismo (fenótipo). Técnicas de análise de DNA determinam sequências para entender desenvolvimento de organismos e erros que causam doenças como câncer. A tecnologia avançou rapidamente após o desenvolvimento do PCR em 1985.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

O PCR é talvez o maior avanço científico em genética. Kary Mullis inventou o PCR em 1985. Permite amplificar regiões específicas de DNA, produzindo milhões de cópias em horas. Usa enzima termoestável TAQ polimerase, isolada da bactéria Thermus aquaticus (vive em fontes termais). Na presença de matérias-primas, a TAQ sintetiza cópias duplicadas do DNA usando o original como molde. Pesquisadores definem a região exata a amplificar incluindo primers de 20 bases que se anexam (anelam) ao molde. Todas as tecnologias posteriores a 1985 requerem derivados de amplificação por PCR.

Técnicas de Sequenciamento de DNA

Sequenciamento determina a ordem exata das bases nitrogenadas. Métodos iniciais marcavam cada base com rótulo radioativo durante PCR. DNA amplificado era separado por corrente elétrica e migrava em gel de poliacrilamida. Limitação: cada base determinada em faixa separada, pois rótulos radioativos parecem iguais na leitura por raio-X. Uma faixa por base. Desenvolvimento de corantes fluorescentes automatizou a tecnologia no início dos anos 1990: cada base com cor diferente. Câmera digital registra cores e envia dados a computador. Sequenciamento automatizado permite até 700 bases vs. limite de 200 para rótulos radioativos.

Desenvolvimento do Sequenciamento Capilar

Por volta de 1997, técnicas evoluíram substituindo placas de vidro bagunçadas e poliacrilamida por capilares de vidro. Não precisava mais verter acrilamida entre placas e esperar gelificar. Sequenciamento feito com polímero viscoso (derivado de poliacrilamida) injetado em fibras de vidro ocas. Amostras ainda amplificadas por PCR e corantes fluorescentes, então carregadas automaticamente em capilares individuais. Resultado: mais automação e capacidade de sequenciar maior número de amostras em menos tempo. Maioria do genoma humano (9 bilhões de bases) foi determinada por sequenciamento capilar.

PCR em Tempo Real

Após determinar sequência de DNA de organismo específico, objetivo seguinte foi buscar variações entre organismos da mesma e de diferentes espécies. Razões: analisar diferenças/semelhanças entre espécies (por que humanos são humanos e gorilas não); usar técnicas genéticas para detectar mutações causadoras de doenças genéticas. PCR em tempo real usa tecnologia similar ao PCR com primer fluorescente adicional para marcar sequência específica. Qualquer erro no DNA impede anelamento do marcador. A capacidade de anelamento é medida durante PCR para determinar presença de mutação.

Tecnologia de Microarray (Chip)

Análise por microarray desenvolveu-se logo após PCR em tempo real, usada principalmente para expressão gênica (determinar quais genes em uma célula estão ativos). Nem todo gene do genoma está ativo. Ativação de genes específicos determina função de diferentes tipos de células em organismos complexos (por que célula da pele não é célula do fígado). Pesquisadores isolam produto de genes ativos na forma de RNA mensageiro (mRNA) e usam técnicas de PCR para produzir complemento de DNA. DNA da amostra é depositado em placa com sondas marcadas que fluorescem na presença de DNA. Placas atuais testam simultaneamente >30.000 amostras.

Sequenciamento de Nova Geração

Desenvolvimento mais recente em tecnologias de análise de DNA. Processo não difere muito do sequenciamento normal, mas equipamento determina sequências genômicas inteiras isoladas de bactérias, 2 milhões de bases de uma vez. Incorpora PCR em emulsão, técnica que usa DNA encapsulado em microesferas ou gotículas de óleo. Aumenta enormemente eficiência do PCR normal e permite amplificar múltiplas regiões de DNA simultaneamente. DNA amplificado é sequenciado em sequenciadores de nova geração especializados. Com o avanço tecnológico, genética tornou-se uma das áreas de pesquisa científica de mais rápido desenvolvimento.