Como Medir a Viabilidade Celular

Na maioria dos experimentos biológicos envolvendo cultura de células, um passo crítico inclui saber quais células estão vivas e quais estão mortas na amostra. Exclusão de corante é o método mais popular para medir viabilidade celular. Baseia-se na teoria de que células vivas possuem membranas íntegras e células mortas não, portanto células mortas absorvem o corante no citoplasma. Existem diferentes corantes e protocolos; a escolha deve basear-se em custo, sensibilidade, facilidade e duração do procedimento. Azul de tripan é corante comum porque o procedimento leva 5 a 10 minutos e custa apenas o reagente do corante.

Materiais Necessários

• Reagente azul de tripan 0,4%
• Hemacitômetro
• Lâmina de cobertura
• Micropipeta
• Ponteiras de pipeta
• Salina fosfatada tamponada (PBS)
• Microscópio de luz

Instruções

1. Obtenha um pellet das células a serem medidas.
2. Ressuspenda o pellet em PBS para obter aproximadamente 5 x 10⁵ células/ml. PBS é usado porque medições de viabilidade são mais precisas quando células estão em ambiente livre de soro; proteínas do soro também podem manchar e dar resultados enganosos.
3. Adicione partes iguais de suspensão celular em PBS a partes iguais de corante azul de tripan 0,4% para obter diluição 1:2 (ex: 100 µl de células para 100 µl de azul de tripan) e misture pipetando para cima e para baixo.
4. Incube a mistura por menos de três minutos à temperatura ambiente. Se células forem contadas após aproximadamente cinco minutos, a viabilidade será imprecisa devido à morte celular.
5. Com a lâmina de cobertura já no lugar, preencha cada lado do hemacitômetro com a suspensão celular. Tipicamente, cada lado leva 10 a 20 µl.
6. Coloque o hemacitômetro no palco do microscópio de luz e foque nas células.
7. Cada lado contém vários quadrados. Conte o número total de células em um quadrado. Depois, conte separadamente células não viáveis (azuis) e viáveis (claras) no mesmo quadrado.
8. Calcule a porcentagem de células viáveis dividindo o número de células viáveis pelo total de células e multiplicando por 100. Repita para vários quadrados para obter média de viabilidade.