Como medir a viabilidade celular

Na maioria dos experimentos biológicos envolvendo cultura de células, um passo crítico inclui saber quais as células estão vivas e que estão mortos em sua amostra. Exclusão Dye é o método mais popular de medir a viabilidade celular . De exclusão de corante baseia-se na teoria de que as células vivas contêm membranas intactas e células mortas não , assim células mortas absorver o corante para dentro do citoplasma . Existem diferentes corantes e protocolos e os métodos que você escolher deve ser baseada no custo , sensibilidade, facilidade e duração do procedimento. Azul de tripano é um corante comum usado para medir a viabilidade das células , porque o processo pode ser realizado em cinco a 10 minutos e custa apenas a quantidade de reagente corante . Coisas que você precisa
azul reagente 0,4% tripan
hemocitômetro
lamínula
micropipeta
pipetas dicas
tampão fosfato ( PBS)
microscópio de luz

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obtenha um pellet de células que você está medindo .
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Ressuspender o pellet celular em PBS para obter cerca de 5 x 105 células /ml . PBS é utilizado porque as medições de viabilidade são mais exactos , quando as células estão em um ambiente livre de soro ; proteínas do soro também pode provocar manchas e dar-lhe resultados enganosos .
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Adicione partes iguais de suspensão de células em PBS com partes iguais de corante azul de tripan 0,4% para obter um 1 a 2 de diluição ( exemplo : . de 100 ul de células e 100 ul de azul de tripano ) e misturar por pipetagem para cima e para baixo
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Incubar mistura para menos de três minutos à temperatura ambiente . Se as células são contadas após cerca de cinco minutos , a viabilidade será impreciso , devido à morte celular.
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Com a lamínula já no lugar , encha cada lado de um contador de hemocitômetro com a suspensão de células . Normalmente, cada lado terá de 10 a 20 ul.
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Coloque o hemocitômetro no palco de um microscópio de luz e foco para as células.
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Cada lado o hemocitômetro contém várias praças . Contar o número total de células em um quadrado do hemacitómetro . Em seguida, contar o número de não-viáveis (azul) e células viáveis (limpar) separadamente , na mesma praça .
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Calcule a porcentagem de células viáveis na praça dividindo-se o número de células viáveis pelo número de células totais e multiplicando por 100 . Faça isso por vários quadrados no hemocitômetro para obter uma medida média de viabilidade.