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Protocolos Genéticos

O ADN genómico fornece o plano para as células se organizarem em organismos vivos. O ADN contém quatro bases nitrogenadas repetidas: adenina, guanina, citosina e timina. Investigadores determinaram com sucesso a sequência completa de bases, o genoma, para muitos organismos complexos, incluindo humanos. Existem muitas razões importantes para sequenciar um genoma. A genética médica preocupa-se com descoberta de anomalias genéticas causadoras de doenças como diabetes, Alzheimer e cancro. Geneticistas evolutivos comparam genomas de espécies relacionadas para desenvolver taxonomia precisa. Protocolos genéticos básicos na investigação são os mesmos independentemente do propósito.

Isolamento de ADN de Células

A investigação genética requer extração de amostra pura de ADN de células. Um protocolo básico começa por desorganizar e remover paredes celulares vegetais ou membranas de células animais com enzima lisozima. Componentes não-genéticos sob forma de precipitados são removidos por centrifugação rápida enquanto o ADN permanece em solução. O ADN é então precipitado na presença de sal acetato de sódio com etanol. Centrifugação final precipita e pelotilha material genético puro para investigação.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A investigação requer cópias suficientes de regiões específicas de ADN. O PCR é método para produzir exponencialmente cópias de ADN. O protocolo requer ADN purificado, polimerase Taq, bases chamadas desoxinucleótidos e pequenos fragmentos de ADN para primar a área designada. A mistura é colocada num termociclador, capaz de mudanças rápidas de temperatura. Aquecer a 95°C separa ADN de dupla fita, depois arrefecer a 48°C para primers anexarem (annealing) a bases correspondentes. Aumenta-se a 72°C quando a polimerase Taq monta desoxinucleótidos (extensão) numa nova cópia do ADN.

Sequenciação Genética de ADN

A sequenciação automatizada determina a sequência exata de bases e compara ADN normal com anormal. O protocolo adiciona dideoxinucleótidos marcados fluorescentemente (ddNTPs) a reações PCR normais, parando aleatoriamente a extensão de fragmentos de ADN. Os produtos são fragmentos diferentes por uma única base. Cada tipo de base tem cor diferente. Produtos finais são carregados num sequenciador automatizado, que separa fragmentos por tamanho num polímero usando corrente elétrica. Quando fragmentos atingem o fim do polímero, câmara digital regista a cor da base e envia dados para análise por computador.

Genotipagem e Impressão Digital de ADN

A genotipagem compara pequenos segmentos de genoma de um organismo a outro. O objetivo é detetar pequenas diferenças no tamanho de fragmentos PCR resultantes de mudanças normais ou acidentais de bases no ADN. O protocolo inicia com PCR básico usando um primer marcado fluorescentemente para deteção em sequenciadores automatizados. Produtos marcados são separados por tamanho e registados por câmara digital para análise por computador. Protocolos de genotipagem são desenhados para identificação forense, impressão digital de ADN, paternidade ou identificação de anomalias genéticas causadoras de doença.