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Lise de Hemácias por Cloreto de Amônio: Mecanismo Osmótico e Uso Laboratorial

O cloreto de amônio (NH₄Cl) lise hemácias (RBCs) via lise osmótica, explorando a permeabilidade única da membrana dos RBCs a NH₃/NH₄⁺.

Mecanismo

1. NH₄Cl se dissocia: NH₄⁺ + Cl⁻.
2. NH₃ (não carregado) difunde rapidamente DENTRO do RBC (alta permeabilidade).
3. Dentro do RBC (pH ~7,2): NH₃ + H⁺ → NH₄⁺ (preso).
4. [NH₄⁺] intracelular sobe → ↑ osmolaridade → influxo de água → inchaço → ruptura.
5. Cl⁻ segue ou entra via trocador de ânions (AE1/Band 3).

Por Que É Seletivo para RBCs

• RBCs não têm mitocôndrias → nenhum ciclo da ureia para detoxificar NH₄⁺.
• Alta permeabilidade ao NH₃ (AQP1, canais RhAG).
• Células nucleadas (glóbulos brancos) metabolizam NH₄⁺ via glutamina sintetase; resistem à lise.

Protocolo Padrão (Tampão de Lise ACK)

• Composição: 150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,2–7,4.
• Concentração: ~0,8% NH₄Cl (8 g/L) – próximo aos 0,9% citados.
• Procedimento: Adicione 1–5 mL de tampão por 1 mL de sangue; incubar 2–5 min à temperatura ambiente; centrifugar; lavar.
• Temperatura: Temperatura ambiente ideal; 4°C retarda a lise.

Aplicações

• Lisar RBCs em sangue total para análise de leucócitos (citometria de fluxo, extração de DNA/RNA).
• Tipagem sanguínea (remover interferência de RBCs).
• Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) (após Ficoll).
• Processamento de medula óssea / baço.

Limitações e Alternativas

• Pode danificar leucócitos se prolongado (>10 min) ou alta concentração.
• Não para ensaios funcionais que requerem membranas intactas.
• Alternativas: Água hipotônica (mais rápida, mais severa), tampões comerciais de lise de RBCs (ex., BD Pharm Lyse, eBioscience).

Segurança

• NH₄Cl é irritante; use luvas, óculos.
• Descarte conforme protocolo de resíduos químicos institucional.