Como Testar Ácidos Nucleicos: Protocolo RT-PCR

Introdução

O teste de ácidos nucleicos é realizado em diagnósticos médicos para detectar patógenos, como vírus ou bactérias. Esses testes são muito mais rápidos e permitem que um médico inicie o tratamento de um paciente que, de outra forma, teria que aguardar a confirmação de infecção usando ensaios baseados em anticorpos mais longos e tediosos. O processo também é conhecido como teste de amplificação de ácido nucleico e inclui um método conhecido como "amplificação por transcriptase reversa" pela reação em cadeia da polimerase. Por ser um procedimento científico altamente especializado, são necessários conhecimentos avançados e experiência em técnicas e teoria de biologia molecular.

Materiais Necessários

• Tubos para PCR
• Ciclo térmico para PCR
• Pipetas e ponteiras com filtro
• Luvas
• Células
• Trizol ou outro reagente de extração de RNA
• Buffer para PCR
• Polimerase Taq
• Primers para RT-PCR a 1 mg/ml
• Água livre de RNase
• dNTPs
• MgCl2
• Primers aleatórios a 1,8 mg/ml
• Transcriptase reversa SuperScript II

Instruções

Processamento e Preparação do RNA

1. Extração de RNA: Coletar células com reagente de extração de RNA, como Trizol. 1 ml é suficiente para coletar células de um poço de uma placa de cultura de tecido de seis poços. As células são pipetadas minuciosamente para homogeneizá-las e, em seguida, realiza-se o procedimento de extração conforme a ficha técnica do Trizol. Brevemente: extrair com clorofórmio, centrifugar para separar as fases de DNA, proteína e RNA. Recuperar apenas a fase de RNA incolor e precipitar com isopropanol. Após incubação, centrifugar e lavar o pellet resultante com várias lavagens de etanol. Ressuspender o pellet em água livre de RNase.
2. Transcrição reversa: Desnaturar exatamente 5 microgramas de RNA a 65°C em volume de 10 microlitros (µl) de água livre de RNase, depois colocar rapidamente no gelo. Para cada reação, combinar: 10 µl de RNA, 3 µl de buffer de reação PCR 10X, 2,5 µl de dNTP 10 mM, 6 µl de cloreto de magnésio 25 mM, 1 µl de primers aleatórios a 1,8 mg/ml, e 0,5 µl de enzima transcriptase reversa SuperScript II. Completar cada reação com 17 µl de água livre de RNase. Incubar os tubos à temperatura ambiente por dez minutos e depois a 42°C por uma hora para produzir o cDNA, depois desnaturar a 95°C e gelar rapidamente para parar a reação.
3. Reação em cadeia da polimerase (PCR): Preparar mistura de reação em tubos de 0,5 ml combinando: 6 µl de cDNA da reação de transcrição reversa, 1,5 µl de buffer de reação PCR 10X, 0,2 µl de polimerase Taq, 0,5 µl de primer reverso e também de primer direto, completar cada tubo com 10,3 µl de água livre de RNase. Para rodar as reações, configurar um ciclador térmico para 30 ciclos: 95°C por 0,5 minuto para desnaturar, seguido por 60°C por 45 segundos para anelar, e finalmente 72°C por 1 minuto para estender o transcrito sintetizado.