Protocolo de ELISA baseada em células

Ensaio imunoenzimático (ELISA) é técnica fundamental em diagnóstico clínico e pesquisa biológica para quantificar proteínas específicas. Aproveitando a especificidade de anticorpos e leitura colorimétrica ou quimioluminescente, ELISA traduz abundância proteica em sinal mensurável.

Cultura celular

Semeie células nos poços de placa de 96 poços na densidade que produza 100 µL de meio por poço. Permita aderência overnight. Para estudos de respostas a estímulos externos, prive células de soro por 24h antes de adicionar fator de interesse.

Fixação e anticorpo primário

Remova meio e fixe células com 3% formaldeído ou metanol. Para acesso do anticorpo, permeabilize membrana com 0,1% Triton X-100 (a menos que fixação com metanol já feita). Bloqueie sítios inespecíficos com 10% soro fetal bovino em PBS. Após bloqueio, adicione anticorpo primário e incube 60 min em temperatura ambiente.

Anticorpo secundário e detecção

Lave células 3x com PBS, aplique anticorpo secundário conjugado a peroxidase de raiz-forte (HRP). Incube 60 min, lave novamente, adicione substrato quimioluminescente. Capture luz emitida com leitor de placa ou sistema de imagem para quantificar níveis proteicos.