Cell- Based protocolo ELISA

ELISA , ou ligada ao ensaio imunoenzimático , é utilizada como uma ferramenta de diagnóstico em medicina e na investigação biológica para quantificar a quantidade de uma proteína específica . ELISA utiliza anticorpos para detectar a proteína de interesse e um reagente que produz uma cor . A quantidade de cor relaciona-se com a quantidade de proteína . Cultura de Células

As células devem ser colocadas em poços de uma placa de 96 poços com 100 microlitros de meio de crescimento e as células deixadas a assentar durante a noite . Se você está estudando reação das células de um fator , as células devem ser por 24 horas e , em seguida, estimulados com o fator em estudo sedentos de soro.
Fixação e anticorpo primário

Após a remoção do meio , as células são tratadas com um fixador tal como formaldeído de 3 por cento , ou metanol . A membrana da célula tem de ser permeabilizadas para permitir que o anticorpo para penetrar na célula . A permeabilização pode ser alcançada através da utilização de 0,1 por cento de Triton , se o metanol não foi anteriormente utilizado . A ligação não específica pode ser prevenida com a utilização de 10 por cento de soro fetal de vitelo diluído em solução salina tamponada com fosfato . Após a remoção do bloco , o anticorpo primário pode ser aplicado e incubou-se durante uma hora.
Anticorpo secundário e Mancha

Remover o anticorpo primário , e lavagem três vezes . Adicionar um anticorpo secundário ligado a um agente de detecção , tais como a peroxidase de rábano . Incubar durante uma hora . Washington Adicionar solução de substrato quimioluminescente. Desenvolver e analisar a placa para a intensidade da cor.