casa |  | Saúde e Doença >  | Saúde Pública e Segurança | Pesquisa Médica

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase): Princípios, Componentes, Etapas e Aplicações

O que é PCR?

PCR (Polymerase Chain Reaction) é técnica de amplificação exponencial in vitro de fragmentos específicos de DNA. Desenvolvida por Kary Mullis (1984, Nobel Química 1993). Base da biologia molecular moderna: diagnóstico, pesquisa, forense, genômica.

Aplicações Principais

• Diagnóstico molecular: patógenos (vírus: HIV, HCV, HPV, SARS-CoV-2, dengue; bactérias: TB, clamídia, gonorreia; parasitas), câncer (mutações, fusões, carga tumoral), doenças genéticas.
• Tipagem HLA / transplante.
• Identificação humana (DNA fingerprinting): forense, paternidade, identificação de vítimas.
• Análise de amostras mínimas/degradadas: DNA antigo (paleogenômica: neandertais, mamutes), histórico.
• Quantificação (qPCR/RT-qPCR): carga viral, expressão gênica, RNA viral (COVID-19).
• Clonagem, sequenciamento, mutagênese, genotipagem.

Componentes Essenciais da Reação

Componente	Função
DNA molde (genômico, cDNA, plasmídeo)	Sequência alvo a ser amplificada
Dois primers (oligonucleotídeos ~18-30 nt)	Forward e reverse, complementares às extremidades 3' do alvo; definem especificidade
DNA polimerase termostável (Taq, Pfu, Phusion, etc.)	Sintetiza nova fita; Taq = padrão (sem proofreading); high-fidelity para clonagem/sequenciamento
dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)	Blocos de construção (substrato)
Buffer de reação (Tris-HCl, KCl, MgCl₂)	pH, força iônica, Mg²⁺ essencial para atividade polimerase
Água nuclease-free	Completa volume

Três Etapas do Ciclo (Repetidas 25-40x)

1. Desnaturação (94-95°C, 15-30s): Quebra pontes de hidrogênio → fitas simples.
2. Hibridização / Annealing (50-65°C, 15-60s): Primers ligam-se às fitas molde. Temperatura crítica: ~5°C abaixo do Tm dos primers.
3. Extensão (72°C, 1 kb/min para Taq): Polimerase estende primers 5'→3' incorporando dNTPs.

Cada ciclo dobra teoricamente o DNA. 30 ciclos → ~1 bilhão de cópias (2³⁰).

Três Fases Cinéticas

1. Exponencial: Reagentes abundantes, duplicação eficiente a cada ciclo.
2. Linear / Level-off: Reagentes limitados (primers, dNTPs, polimerase perde atividade), eficiência cai.
3. Platô: Nenhum produto novo; reagentes esgotados, inibição por produto/pirifosfato.

Tipos Principais de PCR

• PCR convencional (endpoint): Qualitativo (presença/ausência), eletroforese em gel.
• qPCR / Real-time PCR: Quantitativo (curva fluorescência vs ciclo). Sondas: SYBR Green (interno), TaqMan (específica), Molecular Beacons.
• RT-PCR: RNA → cDNA (transcriptase reversa) → PCR. Expressão gênica, vírus RNA.
• PCR digital (dPCR): Particionamento em milhares de micro-reações → contagem absoluta de moléculas (sem curva padrão).
• Multiplex PCR: Múltiplos alvos em uma reação (primers/sondas diferentes).
• Nested PCR: 2 rodadas sequenciais (primers externos → internos) — sensibilidade extrema.

Controles Essenciais

• Controle negativo (sem molde) — contaminação.
• Controle positivo (molde conhecido) — validação.
• Controle de inibição (spike interno) — falsos negativos.
• Controle de casa (housekeeping gene) — normalização RT-qPCR.

Recursos para Aprofundamento

• Yale University: "Designing PCR Programs" (otimização de temperaturas, Mg²⁺, primers).
• University of Utah: "PCR Virtual Lab" (simulação interativa).