Protocolos de purificação de MBP

MBP (proteína de ligação à maltose) encontra-se na bactéria Escherichia coli, parte da flora intestinal de humanos e animais. Purificação de MBP envolve série de procedimentos para separar constituintes da proteína. Em biologia molecular, purificação de MBP é vital para estudo de estrutura e função. Protocolos incluem: purificação de proteínas fundidas a MBP, purificação MBP-fusão em pequena escala e purificação de tag de fusão de proteína de ligação à maltose.

Purificação de proteínas fundidas a MBP

Técnicos lavam 20 ml de resina de polímero amilose com solução Tris pH 7,4, cloreto de sódio, mercaptoetanol (ME) e EDTA (Protocols Online). Amostras celulares adicionadas, centrifugadas e analisadas em eletroforese em gel. Também analisadas em cromatógrafo, onde eluem ou observam constituintes passando pela coluna.

Purificação de proteína MBP-fusão em pequena escala

Segundo Universidade Hebraica de Jerusalém, biólogos usam reagente IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranose), centrifugam cultura 10 min a 8.000 rpm a 4°C (39,2°F). Removem sobrenadante, misturam tampão PBS frio, dividem em tubos e centrifugam novamente. Amostras mantidas a -80°C (-112°F) para análise posterior.

Purificação de tag de fusão de proteína de ligação à maltose

Tags de afinidade são moléculas geneticamente engenheiradas para detectar e purificar proteínas. Protocolo complexo em três etapas: construção de marcador polihistidina (HisMBP); experimento piloto para avaliar solubilidade; purificação em larga escala de MBP (Nature Protocols). Além de E. coli, usam ampicilina, kanamicina, IPTG, anidrotetraciclina, glicose monoidratada, tampão de lise, polimerase DNA, primers PCR, Tris-acetato-EDTA e brometo de etídio.