A coloração intracelular Protocolo para Citometria de Fluxo

Citometria de fluxo é uma ferramenta que é útil no estudo de proteínas celulares . Ele utiliza o de emissão de luz ou fluorescência das proteínas dentro da célula . Os anticorpos ou sondas marcadas com fluorescência são utilizados para estudar proteínas específicas . A citometria de fluxo é utilizada para diagnosticar um certo número de doenças , incluindo o cancro , mas também é útil para a investigação médica . Fixação de Células

As células devem ser fixados para manter a estabilidade das proteínas intracelulares . Um número de agentes fixadores podem ser utilizadas, tais como formaldeído ou acetona gelada . Após a fixação , a membrana da célula tem de ser permealized para permitir que o anticorpo para entrar na célula . Detergentes , como Triton ou NP-40 , ou metanol gelado pode ser usada para fazer buracos na membrana da célula .

Coloração

Lave as células em tampão de bloqueio 0,5 por cento de albumina sérica bovina diluída em solução salina tamponada com fosfato , BSA /PBS . As células são incubadas em tampão de bloqueio para reduzir a ligação não específica . Adicionar anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e deixou -se incubar à temperatura ambiente , para o comprimento optimizado do tempo . Lava-se com tampão de bloqueio .
Análise

Incubar o anticorpo secundário , que é marcado com uma etiqueta fluorescente , a temperatura ambiente durante 30 minutos . Para remover as células não ligadas lavagem anticorpo em tampão de bloqueio . Células de Spin em uma bolinha e , em seguida, ressuspender em PBS e analisar em citômetro de fluxo .