Protocolo de coloração intracelular para citometria de fluxo

Citometria de fluxo é ferramenta útil no estudo de proteínas celulares. Utiliza emissão de luz ou fluorescência de proteínas intracelulares. Anticorpos ou sondas marcadas com fluorescência estudam proteínas específicas. Citometria diagnostica doenças, incluindo câncer, e é útil em pesquisa médica.

Fixação de células

Células devem ser fixadas para manter estabilidade de proteínas intracelulares. Fixativos: formaldeído ou acetona gelada. Após fixação, membrana celular precisa ser permeabilizada para anticorpo entrar. Detergentes como Triton X-100 ou NP-40, ou metanol gelado fazem poros na membrana.

Coloração

Lave células em tampão de bloqueio 0,5% albumina sérica bovina diluída em PBS (BSA/PBS). Incube em tampão de bloqueio para reduzir ligação inespecífica. Adicione anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e incube 60 min em temperatura ambiente. Lave com tampão de bloqueio.

Análise

Incube anticorpo secundário marcado com fluorocromo 30 min em temperatura ambiente. Para remover anticorpo não ligado, lave em tampão de bloqueio. Centrifugue células em pellet, ressuspenda em PBS e analise no citômetro de fluxo.