Como Realizar um Ensaio FRET (Transferência de Energia de Ressonância Fluorescente)

Transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET) é técnica de ensaio para medir presença e quantidade de ligação entre duas proteínas ligadas a repórteres. Comummente usada para analisar proteínas potencialmente ligantes em vários tipos de células, e medir eficácia de enzimas de conjugação. Equipamento de deteção necessário depende dos tipos de moléculas repórter usadas, embora muitas vezes leitor de placas de 96 poços simples possa ser usado.

Materiais Necessários

• Construtos de proteína-de-interesse/molécula repórter para cada proteína testada
• Bloco de placa de 96 poços
• Leitor de placa de 96 poços
• Tamponamento de reação (geralmente base Tris ou fosfato-salino)
• Enzima de conjugação (se necessária)

Instruções

Configuração e Leitura

1. Gere ou prepare construtos de fusão de cada proteína de interesse, cada uma ligada a molécula de transmissão fluorescente como proteína fluorescente verde (GFP), rodamina ou boron-dipirrometeno (BODIPY).

2. Determine comprimentos de onda de absorbância e emissão de cada componente fluorescente e do ensaio global. (Ex.: se ensaio mede transferência GFP→Rodamina, comprimento de onda de excitação é absorbância GFP (488 nm), e deteção de emissão é rodamina (595 nm)).

3. Crie tamponamento de reação apropriado para experiência, dependendo das propriedades bioquímicas das proteínas. Tamponamento baseado em TRIS frequentemente usado, incluindo cloreto de cálcio e 0,05% Tween-20. Concentrações e componentes específicos determinados buscando artigos de jornal detalhando reações e condições similares.

4. Misture as duas proteínas conjugadas a repórteres de interesse em várias concentrações no tamponamento, e aloque 50-200 µl por poço. Adicione enzima de conjugação (ex.: sortase) a cada poço se apropriado. Se ensaio de ponto final, incube à temperatura ambiente (ou temperatura ótima da enzima) por período determinado, depois leia no leitor de 96 poços. Se ensaio cinético, prossiga diretamente para leitura (ver abaixo).

5. Insira placa no leitor de 96 poços. Crie nova página de experiência e aceda menu configurações. Insira comprimentos de onda corretos de excitação (absorbância) e emissão, selecione poços apropriados.
   Se experiência cinética, defina curso temporal e intervalo de leituras (ex.: a cada 10 min).
   Inicie leitura.
   Analise dados usando função gráfica do Microsoft Excel (ou outro programa como GraphPad).