Como Realizar um traste Ensaio

transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET ) é uma técnica de ensaio utilizado para medir a presença e quantidade de ligação entre duas proteínas ligadas ao repórter . Este ensaio é utilizado para analisar as proteínas de ligação potencialmente em vários tipos de células , e para medir a eficácia das enzimas do tipo de conjugação . O equipamento de detecção necessários depende em grande parte dos tipos de moléculas repórter ser utilizados , embora muitas vezes um simples leitor de placa de 96 poços pode ser usado . Coisas que você precisa
Protein-of-interest/Reporter molécula constrói para cada proteína que está sendo testado
96 poços bloco placa
tampão de reação de 96 poços leitor de placas
( geralmente Tris- ou - Fosfato baseado em tampão salina )
Conjugação enzima (se necessário)
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configuração e Leitura
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Gerar ou preparar construções de fusão de cada proteína de interesse , com cada um a ser ligada a uma molécula de fluorescência de transmissão , tais como a proteína fluorescente verde ( GFP ) , rodamina ou boro - dipirrometeno ( BODIPY ) .
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Determinar absorvância e de emissão de comprimentos de onda de cada componente e de fluorescência o ensaio global . ( Por exemplo , se o ensaio mede a GFP - > transferência de energia de fluorescência de rodamina , o comprimento de onda de absorvância de entrada é o de absorção de GFP ( 488 nm ) , e o comprimento de onda de detecção é que a emissão de rodamina ( 595 nm ) )
.
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Criar tampão de reacção adequado para a experiência , dependendo das proteínas de propriedades bioquímicas de interesse . Um tampão à base de Tris é muitas vezes usado , incluindo o cloreto de cálcio e 0,05 por cento de Tween - 20 . As concentrações e os componentes específicos pode ser determinada através da procura de lançamentos detalhando as reacções e condições semelhantes .
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Misturar as duas proteínas repórter conjugado de interesse em várias concentrações no tampão de reacção , e alíquota 50-200 ul por poço . Adicionar uma enzima de conjugação ( por exemplo , sortase ) para cada poço de amostra , se apropriado . Se realizar um ensaio de ponto final , permitir a incubação à temperatura ambiente ( ou a temperatura ideal de enzima ), por um determinado período de tempo , então continue a ler 96 poços leitor de placas . Se realizar um ensaio de cinética , prossiga diretamente para leitura ( veja abaixo). Placa
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Insert amostra em 96 poços leitor de placas . Criar uma nova página experiência e acessar o menu de configurações. Insira o seu valor corrigido (excitação ) e comprimentos de onda de emissão , em seguida, selecione os poços apropriados para serem lidos .

Se a execução de uma experiência cinética , defina o curso de tempo do experimento e leituras período de intervalo (por exemplo, uma vez a cada 10 minutos).

Comece a ler amostra.

Analisar dados usando gráficos de funções do Microsoft Excel (ou outro programa de gráficos como GraphPad ) .