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Procedimentos de Marcação de Anticorpos: Técnicas e Aplicações

Procedimentos de marcação de anticorpos são técnicas usadas nas ciências biológicas para detectar a presença de moléculas específicas. Utilizam a relação entre antígeno e anticorpo. Antígenos podem ser qualquer molécula que o sistema imunológico reconhece. Um anticorpo é uma proteína em forma de Y que reconhece especificamente um único antígeno. Biólogos usam a ligação entre anticorpo e antígeno para determinar a localização de uma molécula específica em uma amostra.

ELISA

ELISA, ou ensaio de imunoabsorção enzimática, é uma técnica de laboratório usada para detectar a presença de um antígeno ou anticorpo. Frequentemente usado em diagnóstico médico para determinar se um paciente foi exposto a um tipo específico de infecção.

Para realizar um ELISA, a amostra — contendo o antígeno de interesse — é ancorada a um suporte sólido em uma placa. Uma solução com o anticorpo complementar é adicionada, e o anticorpo se liga ao antígeno. O excesso de anticorpo é lavado, deixando apenas os pares antígeno-anticorpo ligados. Estes podem ser visualizados adicionando uma molécula fluorescente que se liga ao anticorpo e emite sinal visual, que pode ser quantificado. Assim, a presença e quantidade do antígeno de interesse pode ser determinada indiretamente.

Western Blot

O Western blot é uma técnica diferente usada para detectar uma proteína específica em uma amostra e determinar seu tamanho. Primeiro, as proteínas da amostra são separadas por tamanho em um gel usando eletroforese. Neste ponto, as proteínas não são visíveis a olho nu. Cientistas então transferem as proteínas para uma membrana e adicionam uma solução contendo o anticorpo para o antígeno de interesse. Após lavar o excesso, o anticorpo fica ligado ao antígeno na membrana.

A adição de um anticorpo secundário faz o anticorpo original (primário) emitir luz. Quantificar a luz emitida permite determinar a presença do antígeno, seu tamanho comparado a outras proteínas e sua concentração relativa.

Imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica permite visualizar a localização de uma proteína em uma amostra de tecido. Pequenas fatias da amostra são preparadas e um anticorpo primário, que se liga ao antígeno de interesse, é adicionado. O excesso é lavado antes de adicionar um anticorpo secundário. Este se liga ao par anticorpo primário-antígeno e emite luz, sinalizando a localização do antígeno.

Cientistas usam microscópio para visualizar onde o antígeno está na célula. Múltiplos anticorpos diferentes, cada um específico para uma proteína particular, podem determinar a localização relativa de várias moléculas em uma célula. Se esse for o objetivo, anticorpos secundários de cores diferentes são usados para distinguir entre as diferentes moléculas de interesse.

Citometria de Fluxo

Classificação de células ativada por fluorescência (FACS) é um tipo de citometria de fluxo usada para separar diferentes tipos de células em uma solução. Cada tipo de célula é "marcado" com um anticorpo específico. Cada anticorpo emite uma cor de luz diferente. Uma máquina agita a solução para dividi-la em gotículas individuais e usa um sensor para detectar a cor de cada gotícula. A máquina classifica as células pela cor emitida, dividindo-as com base no tipo de proteína que contêm. A metodologia FACS permite classificar e quantificar células de interesse para questões de pesquisa.

Imuno-microscopia Eletrônica

A microscopia eletrônica normal permite examinar a estrutura de uma célula ampliada até 1 milhão de vezes. A imuno-microscopia eletrônica usa propriedades de ligação anticorpo-antígeno para visualizar proteínas específicas em seções de tecido muito finas. Primeiro, anticorpos com partículas de ouro anexadas são deixados ligar ao antígeno de interesse. Um microscópio eletrônico então visualiza as partículas de ouro, dando uma imagem de onde a proteína está localizada na célula.

Embora simples em teoria, a imuno-microscopia eletrônica é tecnicamente difícil e muito cara, limitando seu uso em muitos programas de pesquisa biológica.