T -Cell Cultura Protocolos

células T , que pertencem a uma família de células do sistema imunológico chamadas linfócitos , são gerados durante uma resposta imune adaptativa. As células T se originam de células -tronco da medula óssea e amadurecem no timo. Existem vários tipos diferentes de células-T , cada um com uma função diferente. As células T são distinguidas uma da outra pelo receptor de antigénio de célula T em anexo. Um subconjunto de células T transporta o marcador CD4 e ajuda a induzir uma resposta imune . Fontes de Células T

as células T podem ser obtidas a partir de várias fontes , incluindo o baço , nódulos linfáticos e timo , sangue periférico , mas é a mais prontamente disponível fonte de células T para fins de cultura . As amostras de sangue são cuidadosamente selecionados para infecções e outros contaminantes e cuidadosamente tratada sob um gabinete de segurança . As células T são cultivados por várias razões , incluindo medições de toxicidade e estudar respostas imunológicas da vacina .
Isolamento

células T são comumente separados a partir de amostras de sangue total por densidade de gradiente de separação , tal como as células T são menos densos do que os glóbulos vermelhos , tais como eritrócitos e , portanto, extraído por centrifugação . Uma solução de sal neutro adequado é adicionado à amostra de sangue , seguido por uma solução isopaque Ficoll . Ficoll isopaque tem uma densidade maior do que as células T , mas menos do que os eritrócitos e , durante a centrifugação forma uma camada intermédia entre as duas células , permitindo que as células T a ser removido a partir do topo . As células T são adicionalmente centrifugado , o sobrenadante é removido , e uma pequena alíquota é contada para determinar a viabilidade celular . As células são utilizadas diretamente para experiências ou criopreservados para uso futuro. Reagentes
Criopreservação

Criopreservação são preparados com antecedência para evitar a degradação das células T no quarto temperatura . Se não for possível , as células foram mantidas em gelo ou refrigerada . Os reagentes consistem em meios de cultura celular e 10-13 por cento de albumina de soro humano ( HSA ) de proteína , bem como meios de cultura de células e 10 por cento de sulfóxido de dimetilo ( DMSO ) . DMSO minimiza desidratação, mudanças de pH , e as mudanças de concentração de eletrólitos associado com o congelamento. As células T são re - suspensos em meio de cultura celular contendo o reagente e HSA num tubo criogénico . O DMSO contendo o reagente é adicionado lentamente para as células e agitado suavemente . As células são então transferidas para um recipiente contendo isopropanol congelação para assegurar uma redução gradual de temperatura e armazenado .
Descongelamento

Quando as células-T são descongeladas , um tubo criogénico é removido de armazenagem e incubou-se a 37 graus Celsius . Subsequentemente , o meio de descongelamento apropriado é adicionado lentamente às células até duas vezes o volume for atingido , transferida para um tubo separado , e centrifugado . Benzonase é por vezes adicionada ao meio de descongelação para evitar que a aglutinação de células T mortas . O sedimento centrifugado é respondida nos meios de cultura de células e a viabilidade das células é avaliada . As células T são, então, pronto para ser usado para os respectivos experimentos.