Solução de Problemas em Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

Introdução

Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é uma técnica comumente usada para separação de moléculas orgânicas em amostras biológicas. Moléculas com menor tamanho e peso migram mais rápido em um gel de poliacrilamida quando uma corrente elétrica é aplicada. Bandas claras e distintas são geralmente observadas após o gel completo ser incubado em um corante específico. É um método relativamente simples. No entanto, ausência de bandas ou bandas borradas ou sujas podem indicar problema em uma ou mais etapas do método. Você deve seguir diretrizes básicas para solucionar problemas de um método de eletroforese em gel quando seus resultados não são os esperados.

O que Você Vai Precisar

• Bis-acrilamida de grau de qualidade ou placas pré-moldadas
• Duas placas de vidro
• Acrilamida: Bis
• Buffer TBE (TRIS, Ácido Bórico, EDTA)
• Fonte de alimentação
• Câmara de buffer superior
• Câmara de buffer inferior
• Amostra de proteína ou DNA
• TEMED
• Persulfato de amônio
• Corante para gel

Instruções

1. Comece pela etapa final da eletroforese em gel primeiro e trabalhe de trás para frente. Para eletroforese em gel, a etapa final é o procedimento de coloração usado para observar bandas da amostra. Poucos problemas devem ocorrer durante a coloração. No entanto, corantes em pó devem ser bem dissolvidos no buffer apropriado antes de serem usados para colorir um gel. Assegure-se de que a concentração correta do corante foi usada.

2. Verifique a fonte de alimentação. A ausência de bandas pode indicar que a configuração de corrente ou tensão estava muito alta e as amostras migraram para fora do gel. Configurações altas também podem fazer com que componentes da amostra migrem pelo gel muito rápido, causando baixa resolução e bandas que parecem sujas. Amostras podem não migrar pelo gel se a configuração da fonte de alimentação for baixa. Amostras também podem desviar do poço onde foram carregadas e não migrar pelo gel.

3. Verifique o acrilamida líquido usado para moldar o gel de poliacrilamida. Tipicamente, a porcentagem de acrilamida usada para moldar um gel varia de 5 a 15%. Amostras compostas por moléculas maiores são carregadas em gel a 5% porque fragmentos grandes se movem mais lento em géis com maior porcentagem de acrilamida. Moléculas pequenas são carregadas em gel de maior porcentagem porque uma baixa concentração de gel não seria capaz de resolver amostras menores.

4. Verifique os reagentes usados para polimerizar o acrilamida. Um gel de poliacrilamida é formado pela polimerização de uma mistura líquida consistindo de bis-acrilamida e acrilamida. Persulfato de amônio e TEMED são adicionados ao acrilamida para catalisar a formação do gel. Tipicamente, o acrilamida deve mostrar sinais de polimerização (formação do gel) 15 minutos após a adição de persulfato de amônio e TEMED. Polimerização que ocorre muito rápido é resultado de altas quantidades de persulfato de amônio. Pouco persulfato pode causar polimerização incompleta ou irregular.

5. Confirme a quantidade de amostras carregadas. Altas concentrações de amostras podem mover-se lentamente pelo gel e reduzir a resolução das bandas. Uma concentração de amostra baixa pode não ser observada após o gel ter sido colorido. Esses corantes têm limitações quanto à quantidade mínima de amostra que pode ser imagemada como resultado da sensibilidade do corante.

6. Confirme a qualidade das amostras carregadas. Sais e outros contaminantes presentes em uma amostra podem afetar o movimento da amostra ao longo do gel. Eletroforese é o resultado de corrente elétrica passando por um gel que contém um buffer condutor de corrente; altas concentrações de sal na amostra podem afetar o movimento dessa corrente pelo gel. Seu isolamento de uma amostra deve incorporar um kit de purificação que produzirá uma amostra relativamente pura.

7. Revise a literatura ou o protocolo escrito para determinar se o PAGE adequado foi usado para conduzir o experimento. A porcentagem de acrilamida no PAGE é específica para o tamanho da amostra a ser testada. A literatura também pode fornecer informações específicas com respeito à configuração da fonte de alimentação e taxa de migração da amostra.