Propagação de plasmídeos recombinantes

Encontrados em algumas espécies de bactérias e leveduras, plasmídeos são anéis de DNA autorreplicantes, comparativamente pequenos, localizados fora do cromossomo principal da célula. São altamente úteis em engenharia genética porque é relativamente fácil inserir genes selecionados de outras espécies nos plasmídeos, transferi-los entre células hospedeiras da mesma ou diferentes espécies, e estimulá-los a replicar — ou propagar — em taxas muito maiores que o normal — ou amplificadas. Plasmídeos recombinantes são aqueles projetados para conter genes de outras espécies. Especialmente com propagação amplificada, plasmídeos recombinantes podem expressar rapidamente proteínas desejadas em grande escala industrial.

Itens Necessários

• Bibliotecas de plasmídeos e genes preexistentes, ou plasmídeos e genes isolados e unidos por você
• Equipamento de cultura de células
• Agentes de amplificação: cloreto de cálcio, choque elétrico, frio e calor, cloranfenicol, enzima Taq polimerase

Instruções

1. Escolha o procedimento de amplificação que melhor se adapte ao seu plasmídeo recombinante e organismo hospedeiro. Alguns funcionam melhor com certos plasmídeos e hospedeiros. Se trabalhando com plasmídeo novo/experimental ou hospedeiro diferente, pode ser necessário determinar o melhor processo por tentativa e erro.

2. Tente o processo de transformação se seu plasmídeo e hospedeiro responderem a ele. Resfrie células e plasmídeos a 0°C em solução de cloreto de cálcio (CaCl2). Aumente rapidamente a temperatura para 37-43°C. Essa mudança brusca faz as membranas celulares absorverem maiores quantidades do plasmídeo.

3. Envie pulsos de eletricidade de alta voltagem através da solução de plasmídeos e células se a eletroporação for o método desejado. Técnica aumenta permeabilidade da membrana aos plasmídeos.

4. Exponha a cultura de células hospedeiras a baixos níveis do antibiótico cloranfenicol para gerar até cem plasmídeos por célula. Método suprime replicação do cromossomo principal do hospedeiro enquanto induz replicação descontrolada do plasmídeo, incluindo gene inserido.

5. Aplique reação em cadeia da polimerase (PCR) para gerar cópias de plasmídeo em ordens de magnitude muito altas. PCR baseia-se em polimerização de DNA, reação pela qual sequências genéticas se formam na natureza. Frequentemente catalisado por enzima termoestável Taq polimerase, extraída de bactéria que vive em fontes termais.