Propagação de recombinantes Plasmids

Encontrado em algumas bactérias e leveduras , plasmídeos são comparativamente pequenos, anéis de auto-replicação de DNA localizados fora cromossomo principal de uma célula. Eles são altamente útil em engenharia genética , porque é relativamente fácil de unir genes selecionados a partir de outras espécies em plasmídeos , transferi-los entre as células hospedeiras da mesma espécie ou diferentes , e estimulá-los para replicar - ou propagar - em muito maior do que do normal - ou amplificados - As taxas . Os plasmídeos recombinantes são simplesmente aqueles que tenham sido modificados para conter genes de outras espécies . Especialmente com a propagação amplificado , os plasmídeos recombinantes podem mais rapidamente e prontamente expressar proteínas desejada em uma larga escala industrial . Coisas que você precisa
plasmídeos e genes bibliotecas pré-existentes, ou plasmídeos e genes você se isolados de seus organismos hospedeiros e emendados juntos
equipamento cultura celular
agente Amplification (s ), tais como cloreto de cálcio, choque elétrico , frio e calor , cloranfenicol , choque elétrico e /ou Taq enzima polimerase
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Escolha o procedimento de amplificação ou procedimentos que melhor se encaixam no seu plasmídeo recombinante específico e acolhimento organismo . Alguns procedimentos trabalhar melhor com certos plasmídeos e computadores do que com os outros. Se você estiver trabalhando com um romance, plasmídeo recombinante ainda experimental e /ou estão experimentando uma espécie de host diferentes , você pode ter que determinar o melhor processo ou processos de amplificação através de tentativa e erro.
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Experimente o processo chamado de transformação se suas espécies plasmídeo e da célula hospedeira específicos pode responder a ela . Relaxe as células e plasmídeos para zero graus C em uma solução de cloreto de cálcio (CaCl ) . Elevar rapidamente a temperatura para 37-43 graus C. Essa mudança brusca de temperatura faz com que as membranas celulares para assumir maiores quantidades de plasmídeo.
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enviar pulsos de energia elétrica de alta tensão através da solução de plasmídeos e células se electroporação é o método de amplificação desejada . Esta técnica aumenta a permeabilidade da membrana da célula para os plasmídeos .
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expor a cultura de células hospedeiras para os baixos níveis do antibiótico cloranfenicol para gerar tantos quanto cem plasmídeos por célula . Este método suprime a replicação do principais cromossomas das células hospedeiras enquanto induz a replicação incontrolada do plasmídeo , incluindo o gene introduzido nele .
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Aplicar a reacção em cadeia da polimerase , ou técnica de PCR para gerar cópias de plasmídeos em muito altas ordens de magnitude . A PCR é baseada na polimerização de DNA , a reacção química , através do qual as sequências genéticas formar na natureza . PCR é mais frequentemente catalisada por uma enzima termoestável chamado a polimerase Taq , extraído de uma espécie bacteriana que vive em águas termais .