Como realizar um teste de Allium cepa

Cebolas (Allium cepa) são usadas para avaliar perigos ambientais permitindo que raízes em desenvolvimento entrem em contato com substâncias a serem testadas. Após exposição suficiente, raízes são removidas, coradas e maceradas para que cromossomos celulares possam ser vistos ao microscópio óptico. Toxicidade é evidenciada se anomalias cromossômicas ou de divisão celular são detectadas. Pontas de raiz são usadas porque as células lá estão crescendo e dividindo ativamente, dando boa chance de ver cromossomos em diferentes estágios.

Itens Necessários

• Cebolas
• Faca
• Água
• Bequeres ou recipientes para líquidos e cebolas
• Líquidos de teste
• Lâmina de barbear ou bisturi
• Frascos
• Fixador aceto-álcool
• Lâminas de microscópio
• Lâminas de cobertura
• Ácido clorídrico
• Haste de maceração de aço inoxidável
• Corante fucsina carbólica
• Corante aceto-orceína
• Ácido acético
• Bálsamo do Canadá
• Microscópio óptico
• Acessório de câmera para microscópio

Instruções

Preparação do Teste

1. Remova a pele externa seca de 12 cebolas. Raspe a base ao redor das placas basais sem danificar a área de onde as raízes emergirão.

2. Selecione bequeres com boca larga para segurar a base das cebolas imersas nos líquidos de teste. Encha com água destilada e coloque as cebolas em contato com a água. Cubra as laterais dos bequeres com papel alumínio para simular escuridão subterrânea. Troque a água diariamente.

3. Examine as bases após dois dias. Raízes devem ter se formado. Avalie crescimento e descarte as duas cebolas com crescimento mais fraco.

4. Prepare uma segunda série de cinco bequeres cada contendo amostra do material a ser testado (ex.: efluente ou escoamento industrial). Coloque cinco cebolas nesses bequeres. Mantenha as outras cinco em água destilada como controles. Permita que raízes cresçam por mais 24 horas.

Preparação das Raízes

5. Com bisturi ou lâmina, colete 5-6 pontas de raiz de cada cebola, registrando quais eram controles e quais testes. Mantenha raízes de cebolas individuais separadas em frascos rotulados.

6. Fixe pontas imediatamente em aceto-álcool na proporção 1:3. Coloque pontas de uma cebola em lâmina e macere em ácido clorídrico 1N (1 molar) a 60°C por três minutos. Corte pontas maceradas com corante fucsina carbólica (mistura de fenol e fucsina básica que liga a elementos de paredes celulares para ficarem mais visíveis em microscopia óptica).

7. Adicione 2% de corante aceto-orceína em 4% de ácido acético. Isso colora os cromossomos. Misture com a haste de maceração. Aplique lâmina de cobertura, pressionando para esmagar as pontas. Sele as bordas com esmalte de secagem rápida ou monte permanentemente em bálsamo do Canadá (resina de abeto balsâmico misturado com óleos essenciais ou xileno). Numere as lâminas para que resultados sejam registrados sem saber se cada uma é teste ou controle.

Registro de Resultados

8. Coloque a lâmina no palco do microscópio óptico. Examine em baixa ampliação, mudando para ampliações maiores para examinar cromossomos.

9. Registre aberrações cromossômicas em ficha de dados, usando número codificado de cada cebola. Inclua cromossomos incompletamente separados ou quebrados, micronúcleos (núcleos extras formados no final da divisão celular que podem conter detritos cromossômicos), anéis cromossômicos e cromossomos pegajosos e perturbados em diferentes estágios. Fotografe cada lâmina.

10. Analise dados usando análise estatística. Interprete resultados para avaliar se a solução de teste é genotóxica.