Como linha para cima DNA para Análise

? Eletroforese em gel de agarose é o método mais comum de análise de fragmentos de DNA visual, que permite que os técnicos fragmentos de DNA visualmente DISCERN com base no tamanho . O gel de agarose sustenta um campo magnético e , uma vez que o ADN tem carga negativa , que se move no sentido da extremidade positiva do campo magnético . Fragmentos de DNA menores movem-se mais rapidamente através do gel e fragmentos maiores se movem mais lentamente. Os fragmentos de DNA são coradas com fluorescência com um agente de intercalação conhecido como brometo de etídio . Isto permite a comparação de várias amostras de ADN a electroforese em um gel . Coisas que você precisa
em gel de agarose , 0,7 por cento a 2 por cento
Tris- borato -EDTA (TBA) , tris -acetato -EDTA ( TAE ), acetato de sódio lítio (LA) , ácido bórico tampão ( SB)
brometo de etídio
Gel corante carregamento
bandeja Gel
Eletroforese câmara
Luvas
óculos de proteção
Pipeta
Eletroforese pente
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Preparar um frasco cónico de 0,7 por cento do gel de agarose
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Pesar 0,7 gramas de pó de agarose e em seguida, coloque em uma grande ( 250 ml) .
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Adicione 100ml de um tampão 1X ( força regular ) ( TAE , TBE , SB ou tampão LB ) para o erlenmeyer contendo o pó de agarose
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microondas ou calor. usando um bico de Bunsen por aproximadamente um minutos até que a solução se torne clara e a agarose se dissolva.
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Retirar o balão da fonte de calor e deixe-o esfriar para 55 a 60 graus Celsius.
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Adicionar 1 ul ( microlitros ) de brometo de etídio à solução de agarose arrefecida utilizando uma pipeta de tamanho adequado , geralmente de 1 ml. Agitar a solução para misturar .
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Despeje o gel lentamente na placa de gel , assegurando que não há a formação de bolhas durante este processo . Se não há bem fornecidos barragens com bandeja de gel , use fita adesiva para formá-los .
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Coloque um pente cuidadosamente eletroforese em gel , garantindo uma posição firme e na orientação correta . Pentes de electroforese pode variar grandemente em número de dentes que têm. Deixar o gel assentar durante cerca de 25 minutos
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submergir o gel no mesmo tampão usado para preparar a solução agaorse - . Neste caso , um tampão 1X . Submergir o gel em até 5 ml de tampão de corrida .
Preparação e Carregamento de DNA no gel de agarose para Análise
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Transferência de 5 a 10 mL de sua amostra ( s ) a partir de seus tubos de reacção para tubos frescos . No caso de você querer usar a mistura de reacção inteiro, um novo tubo não é necessário.
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Adicionar tampão de carregamento 0,2 X para cada um de seus tubos de amostras frescas contendo sua amostra de DNA para o carregamento.

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Retire o pente de electroforese lentamente , garantindo que você não quebrar o gel ou criar qualquer espaço entre o fundo do gel ea bandeja de gel.
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Adicione cinco a 12 mL de um marcador de DNA adequado para o primeiro poço criado pelo pente de electroforese . Seja ou não um marcador de DNA é apropriada depende do tamanho dos fragmentos que você está esperando de sua amostra.
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carga de cinco a 10 mL de suas amostras para os poços restantes e adicione um igual quantidade do mesmo marcador de DNA para o bem final.
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Coloque os eletrodos na câmara de eletroforese , ligando os fios nas tomadas corretas para a câmara e definir o eletrodo para 50 a 150 V.

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Permitir que o gel de correr para uma a quatro horas .
análise dos resultados
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Retire o gel da câmara de gel e colocá-lo quer em um quarto de UV para a identificação visual, ou lugar em uma máquina que é capaz de tirar uma fotografia do gel.
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Meça a distância marcadores da migração em seus poços.

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traçar as distâncias em relação ao tamanho das bandas no papel milimetrado semilog e desenhar uma melhor linha de ajuste.
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Calcule as distâncias de suas bandas desconhecidas.

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Estimar os tamanhos de suas bandas desconhecidas , traçando uma linha a partir da distância percorrida por suas bandas desconhecidas que atende a linha de melhor ajuste.
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Desenhe outra linha a partir deste ponto de encontro para o eixo tamanho.