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Como Preparar DNA para Análise em Gel de Agarose

A eletroforese em gel de agarose é o método mais comum de análise visual de fragmentos de DNA, permitindo que técnicos discernam visualmente fragmentos baseados no tamanho. O gel de agarose sustenta um campo elétrico e, como o DNA tem carga negativa, move-se em direção ao polo positivo. Fragmentos menores movem-se mais rapidamente pelo gel e fragmentos maiores mais lentamente. Fragmentos de DNA são corados fluorescentemente com um agente intercalante, o brometo de etídio, permitindo comparação de várias amostras eletroforesadas no gel.

Materiais Necessários

• Gel de agarose, 0,7% a 2%
• Buffers: Tris-borato-EDTA (TBE), tris-acetato-EDTA (TAE), acetato de sódio-lítio (LA), ácido bórico (SB)
• Brometo de etídio
• Corante de carregamento para gel
• Bandeja para gel
• Câmara de eletroforese
• Luvas
• Óculos de proteção
• Pipeta
• Pente para eletroforese

Instruções

Preparação de Gel de Agarose a 0,7%

1. Pese 0,7 g de pó de agarose e coloque em um balão cônico grande (250 ml).
2. Adicione 100 ml de buffer 1X (concentração regular) (TAE, TBE, SB ou LB) ao balão com o pó.
3. Aqueça no micro-ondas ou com bico de Bunsen por cerca de 1 minuto até a solução ficar clara e a agarose dissolvida.
4. Retire do calor e deixe esfriar a 55–60 °C.
5. Adicione 1 µL de brometo de etídio à solução resfriada usando pipeta apropriada (geralmente 1 ml). Misture girando.
6. Despeje o gel lentamente na bandeja, evitando bolhas. Se não houver represas de poços, use fita adesiva para formá-las.
7. Coloque o pente de eletroforese cuidadosamente no gel, garantindo posição firme e orientação correta. Deixe solidificar por cerca de 25 minutos.
8. Submerja o gel no mesmo buffer usado no preparo (1X). Cubra com até 5 ml de buffer de corrida.

Preparação e Carregamento do DNA no Gel

9. Transfira 5–10 µL de sua(s) amostra(s) dos tubos de reação para tubos novos. Se for usar toda a mistura, tubo novo não é necessário.
10. Adicione buffer de carregamento 0,2X a cada tubo novo com sua amostra de DNA.
11. Remova o pente lentamente, sem quebrar o gel ou criar espaço entre o gel e a bandeja.
12. Adicione 5–12 µL de marcador de DNA apropriado ao primeiro poço. A escolha do marcador depende do tamanho dos fragmentos esperados.
13. Carregue 5–10 µL de suas amostras nos poços restantes e adicione igual quantidade do mesmo marcador no poço final.
14. Conecte os eletrodos na câmara de eletroforese, ligando os fios nos soquetes corretos, e ajuste a voltagem para 50–150 V.
15. Deixe o gel rodar por 1 a 4 horas.

Análise dos Resultados

16. Remova o gel da câmara e coloque em sala UV para identificação visual, ou em equipamento que fotografe o gel.
17. Meça a distância de migração dos marcadores em seus poços.
18. Plote as distâncias contra o tamanho das bandas em papel semilogarítmico e trace uma linha de melhor ajuste.
19. Calcule as distâncias de suas bandas desconhecidas.
20. Estime o tamanho das bandas desconhecidas traçando uma linha a partir da distância percorrida até encontrar a linha de melhor ajuste.
21. Desenhe outra linha desse ponto de encontro até o eixo de tamanho.