Como solucionar problemas de um fragmento de ligação Três

ligadura é um método utilizado na pesquisa biológica para unir vertentes distintas de DNA. O processo foi simplificado utilizando kits de ligação disponíveis comercialmente . Um procedimento de ligação é geralmente seguido por transformação , um processo de inserção do ADN juntou-se um receptor vector bacteriano , clonar e amplificar o ADN . Devido à complexidade do processo , os resultados geralmente não corresponde ao produto desejado e exigir solução de problemas . Isto é mais predominante na tentativa de juntar vários fragmentos , tais como em ligação tripla . Coisas que você precisa
kit ligadura
Ligadura protocolo
Agarose gel
50 X TBA tampão ( 242 g de base Tris , 57,1 ml de ácido acético glacial , 100 ml de 0,5 M EDTA diluído em 1 litro de água )
água deionizada
kit de purificação de DNA
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Solucionar transformação
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Formular uma lista de passos envolvidos na ligação e transformação. Solução de problemas qualquer protocolo científico geralmente começa com o passo final , no sentido inverso .
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comparar produto de ADN purificado a partir da amostra de DNA de controlo , fornecido com o kit . Uma vez que o DNA foi transformado em bactérias e clonado , pode ser isolado , purificado e verificado por electroforese em gel de agarose . Os resultados para eletroforese indicaria se a transformação foi bem sucedida.
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Determinar o crescimento bacteriano durante a clonagem . A maioria dos vectores bacterianos são construídos de modo a apenas aqueles com um inserto de DNA - crescerá num meio contendo ampicilina , ou outro antibiótico . O fraco crescimento poderia estabelecer que a amostra de DNA não foi inserido com sucesso no vetor.
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Confirme que a amostra de DNA ligado foi purificado , antes da transformação . Sais de tampão de ligação e enzimas, podem inibir a transformação do ADN inserido . É também importante assegurar que a enzima de ligação foi inactivado por calor , após a conclusão do procedimento de ligação. Ligase atividade potencialmente poderiam interferir com a transformação.
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Verifique a data em estoque bacteriana utilizada para a transformação. Células bacterianas velhos perdem eficiência ao longo do tempo . Eventualmente, as células bacterianas são incapazes de transformação e clonagem de qualidade. Uma vez que o processo de transformação foi diagnosticada , você pode começar a analisar o procedimento de ligadura .
Troubleshooting Ligadura
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Confirme a pureza de sua amostra de DNA, antes da ligadura . Contaminantes de sal na amostra de DNA pode resultar em má ligadura . A amostra de ADN deve ser purificado e livre de sais e enzimas , antes de ser utilizado na ligação.
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Confirmar se as extremidades das cadeias de ADN a ser ligados são sem corte ou pegajoso . Ligadura é usado para ligar fios separados com extremidades planas ou extremidades pegajosas , após digestão com enzimas de restrição designados. T4 DNA ligase é a enzima de escolha para DNA fim brusco - mas que também irá trabalhar para DNA com extremidades pegajosas . Outros ligases de DNA só pode funcionar para DNA , seguindo uma restrição digerir para criar extremidades pegajosas . É importante utilizar a ligase adequada para o ADN testado .
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Verificar a concentração de amostras de ADN antes da ligação . Usando o ADN com alta concentração muitas vezes faz com que o ADN se tornar linear . As instruções do kit irá fornecer informações sobre a quantidade correta de DNA para uso em uma reação de ligação .
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Substituir enzima ligase com um novo lote . Enzimas são particularmente sensíveis à temperatura ambiente e ciclos de congelamento e descongelamento continuadas . A ligase pode ser danificado após uma série de usos, simplesmente por congelamento e descongelamento muitas vezes. Alguns kits recomendam que ligase ser aliquotado em pequenas porções durante o uso inicial , para reduzir o número de vezes que ele é re- congelado.
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Verifique o kit ligadura . Muitas vezes o problema com ligadura está usando um kit que tenha expirado ou sido contaminado com outro DNA e sais .