Solução de Problemas em Ligação Tripla (Triple Ligation) de DNA

Ligação é método em pesquisa biológica para unir fitas de DNA separadas. Kits comerciais simplificaram o processo. Geralmente seguido de transformação (inserção do DNA unido em vetor bacteriano) para clonar/amplificar. Devido à complexidade, resultados muitas vezes divergem do desejado, exigindo solução de problemas — mais comum em ligações de múltiplos fragmentos (tripla ligação).

Materiais Necessários

• Kit de ligação
• Protocolo de ligação
• Gel de agarose
• Buffer TBA 50X (242 g Tris base, 57,1 ml ácido acético glacial, 100 ml EDTA 0,5 M diluído a 1 L com água)
• Água desionizada
• Kit de purificação de DNA

Solução de Problemas — Transformação

1. Liste passos de ligação e transformação. Solucione do final para o início.
2. Compare DNA purificado da amostra ao DNA controle (do kit). Após transformação/clonagem em bactérias, isole, purifique e verifique por eletroforese em gel de agarose. Resultado indica se transformação funcionou.
3. Verifique crescimento bacteriano na clonagem. Vetores geralmente crescem em meio com ampicilina/antibiótico só se tiverem inserto de DNA. Crescimento fraco sugere inserção mal-sucedida.
4. Confirme que DNA ligado foi purificado antes da transformação. Sais de buffer e enzimas de ligação podem inibir transformação. Importante: enzima de ligação inativada por calor após ligação. Ligase ativa pode interferir.
5. Verifique data do estoque bacteriano. Células velhas perdem eficiência; eventualmente ficam incapazes de transformação/clonagem de qualidade. Diagnosticada a transformação, analise a ligação.

Solução de Problemas — Ligação

6. Confirme pureza do DNA antes da ligação. Contaminantes de sal causam ligação ruim. DNA deve ser purificado, livre de sais e enzimas.
7. Confirme se extremidades das fitas são blunt (rombas) ou sticky (coesivas). Ligação une fitas com extremidades rombas ou coesivas (após digestão com enzimas de restrição). T4 DNA ligase é escolha para extremidades rombas — também funciona para coesivas. Outras ligases só funcionam após digestão para criar extremidades coesivas. Use ligase adequada.
8. Verifique concentração de DNA antes da ligação. Alta concentração lineariza DNA. Instruções do kit indicam quantidade correta.
9. Substitua enzima ligase por lote novo. Enzimas são sensíveis à temperatura ambiente e ciclos de congelamento/descongelamento. Ligase pode danificar após muitos usos. Alguns kits recomendam alíquotas menores no primeiro uso para reduzir recongelamentos.
10. Verifique o kit de ligação. Problema comum: kit vencido ou contaminado com DNA/sais estranhos.