Como Rotular Produtos de Substrato de Protease: Protocolo Laboratorial

Proteínas são componentes de todas as células do corpo. Proteases (também chamadas de enzimas proteolíticas ou proteinases) são enzimas digestivas cuja função é quebrar proteínas. Além da digestão, proteases são essenciais para coagulação sanguínea, controle metabólico e regulação imunológica. Durante o processo bioquímico (catálise), substratos se ligam ao sítio ativo da enzima e são transformados em um ou mais produtos que são então liberados. Esse processo pode ser aumentado ou inibido para incrementar ou reduzir reações no corpo, dependendo do resultado desejado. A rotulagem de produtos de substrato permite que cientistas meçam essa atividade enzimática. A rotulagem fluorescente é uma técnica usada para colorir moléculas específicas, facilitando seu rastreamento.

Materiais Necessários

• Coquetel de molécula-alvo
• Kit de rotulagem com corante fluorescente
• Instrumento de leitura de fluorescência

Procedimento: Como Rotular Produtos de Substrato de Protease

1. Escolha seu corante fluorescente. Corantes comuns incluem rodamina e fluoresceína. Geralmente podem ser adquiridos de fabricantes.
2. Execute a reação e remova fluoróforo não utilizado das moléculas-alvo usando cromatografia de exclusão por tamanho (processo que separa moléculas com base em seu tamanho). Colunas de remoção de corante também são comumente usadas e frequentemente anunciadas junto com kits de rotulagem.
3. Detecte as moléculas. Use um instrumento de leitura de fluorescência, como microscópio de fluorescência. Luz de um comprimento de onda específico passa pela molécula (indiretamente em algumas técnicas), iluminando o fluoróforo.
4. Realize as medições. Como ensaios medem quanto substrato foi consumido ou a quantidade de produto liberado ao longo do tempo, quantidades enzimáticas podem ser medidas em mols (quantidade física) ou em unidades enzimáticas (atividade).