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Protocolos de Ensaio NBT (Nitro Blue Tetrazólio)

Visão Geral

NBT (nitro blue tetrazólio) é composto químico usado em bioquímica e imunologia para detectar enzima fosfatase alcalina. Também usado no teste diagnóstico de doença granulomatosa crônica, que afeta células de imunodefesa. Protocolos de ensaio NBT incluem: imunoblotting, solução substrato BCIP/NBT fosfatase alcalina, detecção de atividades de galactosidase e fosfatase alcalina em tecido.

Imunoblotting

Técnica para detectar anticorpos (proteínas do processo de imunodefesa), segundo Susan R. Haynes em "RNA-Protein Interaction Protocols". Envolve uso de NBT, albumina sérica bovina, anticorpos primários 9E10, solução de coloração Comassie, membranas de nitrocelulose, solução tampão Tris base, persulfato de amônio, dodecil sulfato de sódio e butanol saturado com água.

Solução Substrato BCIP/NBT Fosfatase Alcalina

Técnicos preparam solução com: 3 gotas de 1% BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato), 3 gotas de 1,5% NBT, 2 gotas de levamisol e tampão fosfatase alcalina (AP) pH 9,5 (conforme site IHC World). Incubam em temperatura ambiente até ficar disponível para uso.

Detecção de Galactosidase e Fosfatase Alcalina em Tecido

Galactosidases quebram molécula galactosídeo, presente em E. coli e outros organismos. Segundo Protocol Online, usam-se amostras de células de rato tratadas com PBS, glutaraldeído e paraformaldeído. Prepara-se tampão de reação X-gal (bromo-cloro-indolil-galactopiranosídeo) com ferrocianeto de potássio, cloreto de magnésio, desoxicolato de sódio e detergente Nonidet P-40. NBT pode substituir ferrocianeto de potássio como alternativa mais rápida. Amostras são observadas ao microscópio.