O que é o gel de electroforese

? Electroforese em gel é um método de separação , identificação e caracterização das misturas de proteínas ou ácidos nucleicos . Amostras desnaturadas migrar após a aplicação de eletricidade em um gel fino , molhado normalmente feitas de poliacrilamida ou agarose. As amostras separadas estão manchadas para que eles possam ser vistos. A electroforese em gel é usado na pesquisa de proteínas e ácidos nucleicos e em hospitais para identificar proteínas ou padrões de ADN pouco usuais para diagnosticar doenças , defeitos genéticos e relações genéticas . Preparação de amostras

Quando um detergente tal como dodecylsulfonate de sódio ( SDS ) é adicionado a uma proteína ou ácido nucleico , o detergente irá associar-se com proteínas e desdobrar ( desnaturado) e ácido nucleico . A desnaturação de proteínas faz com que seja mais fácil de determinar o seu peso molecular em electroforese . A quantidade de amostra requerida é tipicamente de 100 a 500 nanogramas por banda amostra de proteínas e entre 5 e 100 ng por banda de ácidos nucleicos em um volume total de cerca de 25 a 40 microlitros .
Géis

Um gel , normalmente feitas de poliacrilamida ou de agarose , podem ser preparados ou adquiridos para separar estas proteínas . O gel é muito parecido com gelatina. É, sobretudo, a água, mas é sólido o suficiente para o manuseio. Os geles contêm tampão para controlar o pH . O gel é muito fina ( 1-2 mm) e rectangular . Um lado parece um pente com um monte de dentes perdidos . As lacunas são chamados poços.
Amostra Carregando

One coloca o gel em uma câmara com tampão e proteínas desnaturadas são adicionados aos poços. Amostras de pesos moleculares conhecidos são adicionados às cavidades exteriores . Os géis são feitas com diferentes quantidades de poliacrilamida . A força do gel baixa ( 4 por cento ) é melhor para a separação de moléculas de elevado peso molecular , enquanto que uma força do gel mais elevada ( 12 por cento ) é usado para as moléculas de maior peso molecular . Um gel de gradiente varia de resistência do gel e pode separar uma grande variedade de proteínas , com a perda de cerca de resolução .
Eletromigração

Com a aplicação de uma tensão eléctrica elevada , as proteínas desnaturadas se mover em direção ao fundo do poço. Quanto maior for o peso da proteína , o que se move mais lentamente . Quando a eletricidade é desligada , as proteínas parar de se mover . Uma remove o gel a partir da câmara e rochas num prato com o corante . Corantes orgânicos tais como corantes de azul de Coomassie ou de metal são usados para proteínas de manchas , enquanto as tinturas fluorescentes tais como o brometo de etídio são utilizados para os ácidos nucleicos .
Análise dos Resultados

Com o remoção do excesso de corante , pode-se ver que as misturas separadas em bandas que se parecem com escadas . A posição das bandas é comparada com a distância percorrida pelos padrões para determinar o peso molecular da amostra em cada banda . O gel pode ser desidratado com álcool e seca para que possa ser salvo. A intensidade da cor da banda , em seguida, pode ser medida para determinar a concentração de proteína em cada banda.
Protocolo Desenvolvimento

protocolos padrão estão disponíveis para trabalhar com o bem- proteínas conhecidas . Se um pesquisador trabalha com uma amostra desconhecida, a força de gel, tipo buffer, pH , tensão , tempo de execução e mancha pode tudo precisa ser otimizado para obter a melhor separação e do sinal.
Protocolos