Como fazer diluições de anticorpos para IHC

Imuno-histoquímica (IHQ ) é uma técnica especialista usado por cientistas para visualizar as células dentro dos tecidos que foram colocadas em uma lâmina e corados com um anticorpo apropriado que reconhece uma proteína que é exclusivo para a célula ou tecido sob investigação. Diluições de anticorpos ( titulações ) , deve ser realizada utilizando as condições experimentais especificadas no protocolo do próprio usuário , não que de fabricante do anticorpo , uma vez que os dois podem não ser idênticas. Coisas que você precisa
Células para manchar
Anticorpo
tampão de diluição ( " diluente " )
Pipettes e dicas
microtubo
Aluminium foil
marcadores laboratoriais e rótulos de tubos
Ice
caixa de lâminas protegido da luz
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verificar e preparar o anticorpo . Verifique se o anticorpo foi levantada no host correto , e reage com a versão exata da proteína (conhecido como a isoforma , ou variante de splicing ) que está sendo testado. Com uma pipeta , tomar cuidadosamente uma porção de 10 microlitros desta e rotular como " estoque pessoal".

Se apenas pequenas quantidades de anticorpos estão disponíveis , pule esta etapa .

Manter um estoque pessoal de anticorpos é prática de rotina em todos os laboratórios , pois evita a contaminação cruzada da peça em bruto . Dispensar este num tubo de microcentrífuga protegido da luz , ou de um tubo de microcentrífuga normal, que é envolvida em folha de alumínio para proteger da luz directa .

Manter este tubo em gelo , de preferência numa Esky com uma tampa estanque ao ar , novamente para minimizar a luz , o que pode destruir o anticorpo . Fazer uma nota de concentração da peça original ( por exemplo, 100 unidades por mililitro , 1 miligrama por microlitro e assim por diante ) no tubo , incluindo o nome do anticorpo e que , se for o caso , do tampão é diluída em ( por exemplo, soro , solução salina , ou água, etc ) .
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Preparar o tampão de diluição , também conhecido como o diluente de anticorpo . Verifique se este é compatível com o anticorpo eo procedimento de imunohistoquímica a ser utilizado, por exemplo , não deve obscurecer qualquer fluorescência ou inibir qualquer posterior rotulagem anticorpo secundário . Fazer uma diluição padrão de imuno-histoquímica ( também o tampão de bloqueio ) por mistura de solução salina tamponada com fosfato 1X com 1 % de Triton - X100 , 10 % de soro fetal de bezerro e 0,2 % de azida de sódio .
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Titular o anticorpo . Com a concentração dada de anticorpo no estoque pessoal ( expressa em unidades de concentração , tais como microgramas por microlitro ) , determinar o volume de anticorpo necessário para obter 10 microgramas de anticorpo .

Defina -se uma série de diluição pipetando um volume equivalente a 2 microgramas de anticorpos (por exemplo microlitros X ), em 100 microlitros de diluente e misture bem por pipetagem cima e para baixo . A partir desta diluição inicial , tomar as mesmas microlitros X e acrescentar que para um subseqüentes 100 microlitros de diluente . Repita este procedimento até 8-10 diluições (ou uma série ) é composta .

O último tubo terá, portanto, a menor concentração e ser a " saturação " concentração que irá gerar o máximo nível de sinal durante a experiência . No entanto , a concentração ideal será ligeiramente mais concentrado do que esta , de modo que não excesso de sinal é produzido , o que pode causar erros de fundo .

Rotular os tubos correctamente com os novos concentrações diluídas .