Como medir o NADH

NAD e NADH são os dois nucleotídeos de piridina envolvidas no metabolismo . NADH e NAD são co- enzimas encontradas nas mitocôndrias , as potências da célula . Ambos NAD e NADH estão envolvidos nas reações celulares, tais como a respiração ea fotossíntese , onde a energia e hidrogênio são gerados. NAD NADH e combustível reacções bioquímicas que requerem um número de enzimas para a produção de ATP , a fonte de energia principal das células . Coisas que você precisa
células ou tecidos em estudo
kit de ensaio NADH
salina fosfato - tamponada
Dry Ice
bloco Aquecimento
placa de 96 poços
Centrífuga
rotulada tubos
Placa leitor
Vortex
concentração conhecida de NADH
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Ensaio
1

lavar as células ou tecidos em estudo com fosfato de frio salina tamponada , PBS. Extrair as células ou romper o tecido em tampão de extracção , colocando a mistura em gelo seco durante 20 minutos e em seguida à temperatura ambiente durante 10 minutos. Repita .
2

Vortex por 10 segundos. Girar numa centrífuga durante 5 minutos para sedimentar os detritos de célula ou tecido . Remover o sobrenadante , a fase líquida , e colocar o líquido num tubo de ensaio limpo .
3

Filtrar o sobrenadante através de um filtro especializado para remover enzimas que vai desagregação NADH .
4

Remover 200 micro litros, coloque em um tubo limpo e calor a 60 graus Celsius em um bloco de aquecimento por 30 minutos para desnaturar NAD . Fase líquida fresco e centrifugar e remover. Transferir 50 microlitros para uma placa de 96 poços ; cada amostra deve estar em duplicado ou triplicado . Para determinar NAD total NADt , não aquecem .
5

preparar e adicionar ciclismo mistura para a placa de 96 poços . Misturar e incubar durante 5 minutos . Adicionam-se 10 micro litros de revelador e deixou -se incubar à temperatura ambiente durante até 4 horas. Adicionar solução de parada . Leia mudança de cor em um leitor de placas ou fluorímetro dependendo kit.
Curva padrão e Cálculo
6

Preparar uma curva padrão , tendo uma concentração conhecida de NADH e diluir em tampão de extracção . Dilui-se em diferentes concentrações , assegurando o volume final é a mesma que as amostras de teste . Placa na mesma placa de 96 poços como as amostras de teste . Ler a densidade óptica .
7

desenhar o gráfico da curva padrão com a concentração no eixo X e a densidade óptica no eixo Y . Tome uma média de cada amostra e ler a concentração do gráfico da curva padrão.
8

Calcule a razão NAD /NADH subtraindo NAD total NADt , de NADH e depois dividir por NADH.